布尼亞病毒基因重排機制研究進展

石坤 林祥梅 呂繼洲 鄧俊花 吳紹強

（中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京 100176）

近年來，發熱伴血小板減少綜合征（俗稱“蜱咬病”）、施馬倫貝格病等的新發引起人類對布尼亞病毒的廣泛關注。布尼亞病毒是一類傳染性強、致死率高的負鏈RNA病毒，許多布尼亞病毒可引起嚴重的人類疾病。如漢坦病毒科的漢坦病毒可引起嚴重的人畜共患病，世界衛生組織已將其列為可通過氣溶膠傳播的生物武器［1］。該病原體于1978年在韓國漢坦河附近被分離到。1993年，美國的亞利桑那州、科羅拉多州、新墨西哥州和猶他州暴發的“死亡的峽谷”，病原即為漢坦病毒，死亡率高達50%［2］。在南美洲和中美洲流行的人畜共患病——奧羅普切熱的病原為周布尼亞病毒科的奧羅普切病毒（Oropouche virus，OROV）。在過去的60年中，巴西、秘魯、巴拿馬、特立尼達和多巴哥報道了30多起流行病和超過50萬例OROV感染的臨床病例。在巴西，奧羅普切熱被認為是除登革熱以外第二種最常見的蟲媒病毒性發熱疾病［3］。1965年以來我國新疆巴楚地區爆發的出血熱疫情的病原為克里米亞-剛果出血熱病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV），此后該病在南疆地區一直流行，死亡率達30%［4］。2010年夏季，我國河南等地爆發的由蜱蟲叮咬引發的“蜱咬病”的病原為發熱伴血小板減少綜合癥病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV），死亡率達12%-30%［5］。此外，裂谷熱病毒（Rift valley fever virus，RVFV）、布尼韋爾病毒（Bunyamwera virus，BUNV）、拉克羅斯病毒（La Crosse encephalitis virus、LACV）、巴泰病毒（Batai，BATV）及阿里病毒（Ngari，NRIV）則能夠在家畜、鳥類和人類中引發疾病。

1 布尼亞病毒的基因組結構與功能

布尼亞病毒是目前已知最大的RNA病毒家族，已發現350多種病毒［6］。由于布尼亞病毒數目龐大，2016年召開的第10次國際病毒分類委員會（ICTV）會議上將布尼亞病毒科升級為布尼亞病毒目，由周布尼亞病毒科（Peribunyaviridae）、白細病毒科（Phenuiviridae）、漢坦病毒科（Hantaviridae）和內羅病毒科（Nairoviridae）等9個科組成。絕大多數布尼亞病毒基因組均由3條單股負鏈RNA組成，分別為大（L）、中（M）、小（S）三段。它們都含有一個編碼區以及編碼區兩側的3' UTRs和5' UTRs。其中同一種屬內的基因組RNA片段大小一致，L基因約為6.9 kb，M基因約為4.5 kb和S基因約為1.0 kb（圖1），其中S基因編碼N蛋白，M基因編碼糖蛋白前體，L基因編碼RNA 依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）。糖蛋白前體為多蛋白體，其中含有非結構蛋白NSm。M基因的mRNA在宿主蛋白酶作用下翻譯產生3種蛋白質，編碼順序是Gn-NSm-Gc。布尼亞病毒顆粒呈球形，直徑為80-140 nm，包括4種結構蛋白：兩種表面糖蛋白，分別稱為Gn和Gc，主要介導病毒的入侵；兩種內部蛋白質，分別稱為N蛋白和L蛋白，其中N蛋白為核衣殼蛋白，它將布尼亞病毒的L、M和S三個RNA節段基因組包裹，并與RdRp形成核糖核蛋白復合物（Ribonucleoprotein complex，RNP），并被包裹在脂質囊膜中，負責病毒轉錄和復制。L蛋白質為RdRp，在病毒轉錄和復制中起到重要的作用。

2 自然界中的布尼亞病毒重排

布尼亞病毒之所以種類繁多，是因為其基因組易發生變異的關系。布尼亞病毒基因組的分段性質，增加了病毒成員之間基因重排的機率，這種現象在幾年前已經被反復驗證。最新的ICTV分類建議列出了48種漢坦病毒，除澳大利亞和南極洲以外的所有大洲均有分布［7］。在美國發現漢坦病毒肺綜合征及其病原體辛諾柏病毒（Sin nombre virus，SNV）后，很快就檢測到它的重組體。尤其是SNV中的NMR11和CC107這兩種親緣關系密切的毒株感染同一個嚙齒動物時，基因重排的現象非常普遍［2］。Luis 等和Saeed等［8-9］用 SNV的毒株NMR11和 CC107混合感染Vero E6細胞時產生了294個子代噬斑，其中25個噬斑為重組體，重組率為8.5%。賈托巴病毒（Jatobal，JATV）是在1985年從巴西帕拉州的南美長鼻浣熊中分離出來的，JATV和OROV序列在核苷酸水平上的相似性為65.6%，其中S片段與OROV的秘魯基因型相似性高達95.9%-97.3%。這些結果表明，JATV很可能是含有OROV的S片段的重配體［9］。伊基托斯病毒（Iquitos，IQTV）于1999年首次從秘魯伊基托斯的一名發燒患者身上分離到。它也是OROV的重組體［10］。這種病毒擁有OROV的S和L片段。核酸序列分析表明，歐洲2011新發的SBV的M片段與薩蘇伯里病毒（Sathuperi virus，SATV）的日本株的序列相似性在81.8%-82.2%之間，與沙門達病毒（Shamonda virus，SHAV）的S片段相似性為 97%，L片段的相似性是94%，SBV可能是SATV與SHAV的基因重排產物［11］。AKAV的分離株之間的基因重排也非常頻繁，Kobayashi等［12］對日本、臺灣、澳大利亞和肯尼亞的赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）以及澳大利亞和日本發現的蒂納羅病毒（Tinaroo virus，TINV）進行了測序和系統遺傳學分析發現，TINV的S和L片段來自AKAV。此外，研究表明在自然界中，NRIV是BUNV和BATV產生的一個重組株，艾諾病毒（Aino virus，AINOV） 和 皮 通 病 毒 PEAV（Peaton virus，PEAV）之間也產生了一種重組株［13-14］。

3 布尼亞病毒的基因重排機理

3.1 布尼亞病毒的基因重排的分子機制

所有分節段的RNA病毒在共感染過程中都具有交換基因組片段的能力，具體而言，當兩種或更多種病毒感染單個宿主細胞時，它們可將彼此的基因組片段包裝到新生病毒粒子中，從而產生雜交后代，流感病毒大流行中變異毒株的出現證實了上述觀點［15］。與所有負鏈RNA病毒一樣，布尼亞病毒依賴RNA聚合酶（RdRp）缺乏核酸校對功能，病毒復制而產生的基因組數量龐大，這有助于基因變異的產生。由于布尼亞病毒結構的“分節段”性，使它們能夠更容易、更快速重組它們的基因組片段，當兩種不同的病毒同時感染單個細胞，除了可以產生與親本病毒相同的后代外，基因重排還可產生6種潛在的重組病毒（圖2）［16］。然而，這種重排的發生也是有限制的，在Iroegbu和Pringle等［17］進行的體外實驗證明，基因重排只發生在關系密切的布尼亞病毒之間，且這些病毒的基因組片段相互兼容，才可能產生有效的重配株。對某些不相容的病毒基因組片段組合還有更多的限制。相關研究還顯示，現有的布尼亞病毒重組體傾向于L和S片段來自親本病毒，M片段來自供體病毒［17］。因為L和S片段編碼病毒復制必不可少的N蛋白以及病毒RNA聚合酶，而M片段編碼Gn和Gc蛋白，其可以和宿主細胞上的附著受體和進入受體結合，在病毒傳播和媒介范圍選擇方面起到重要作用。因此，來自供體的M片段使重組子代病毒會含有新的遺傳信息，潛在地改變該病毒對組織和宿主的嗜性［18］。

3.2 蚊子體內布尼亞病毒基因重排的發生機制

Chastel認為，被蟲媒叮咬后無感染癥狀的宿主可能會成為“特洛伊木馬”，將流行的蟲媒病毒傳入非疫區［16］。脊椎動物與作為病毒載體的節肢動物蟲媒發生短時間密切接觸后可以充當病毒的“生物容器”。當蚊子同時感染兩種不同的布尼亞病毒時，就可能導致基因重排。因為蟲媒病毒能夠在嗜血節肢動物和脊椎動物中交替地復制，對脊椎動物的細胞有溶解性的破壞，但對節肢動物的細胞很少或沒有致病力。而且，節肢動物宿主是不產生抗體的，更有利于病毒的感染和復制［19］。

以吸食血液為生的節肢動物在其生命周期內可能會吸食多次血液，這就增加了雙重病毒感染的機率，因此也會增加基因重排的機會。絕大多數重組病毒被預測是由蚊子而不是由蜱傳播而來的，這可能是由于雙翅類動物的覓食方式決定，因為蚊子可以在不同的脊椎動物身上進食，而這些脊椎動物可能會感染不同的病毒，因而基因組片段的重排機率很高；而蜱的壽命雖然較長，但卻很少進食，從而減少了雙重感染的機率［19］。布尼亞病毒在蚊子體內進行基因重排的前提是蚊子必須感染兩種不同的病毒，在自然界中存在以下幾種感染機制。一是口服感染，同一只蚊子吸入兩種感染不同病毒的宿主血液，在這個過程中，它可能會多次吸食血液，或者是吸食一個宿主的血液時被打斷，接著在另一個寄主身上吸血結束［20］。自然界中共感染的發生又受雙重感染抗性的限制，即在感染第一種病毒后一段時間內，再次感染第二種病毒受到抑制。這種雙重感染阻力的現象在布尼亞病毒中同時存在，多發生在感染第一種病毒后的幾天內并隨著時間的推移而加重，限制了基因重排的發生。第二種機制是經卵感染，如果雌蚊本身攜帶病毒，它的子代也會攜帶與母體相同的病毒［21］。第三種機制是交配傳播病毒，如LACV或TAHV可與另一種加利福尼亞血清群的正布尼亞病毒發生雙重感染。原因可能是經卵感染一種病毒的雄蚊對感染異種病毒的雌蚊進行授精，導致雌蚊的雙重感染。由于經卵感染的蚊子可能要比口服感染相同病毒的蚊子在中腸中的病毒滴度要低得多，所以使雙重感染阻力減小，經卵感染一種布尼亞病毒的蚊子還能感染另一種布尼亞病毒［22-23］。

4 基因重排的潛在危害

基因重排可使現有的變異株基因庫進行隨機重新分配，使病毒能夠適應不斷變化的生態環境，并且還支持不同病毒之間的重排，這樣更容易產生新的遺傳性狀，從而改變子代病毒的毒性。尤其是基因型漂移和轉變會改變病毒的致病性，而且多表現為毒性增加。根據親代病毒和子代的特征，基因重排可產生病原性、媒介和宿主范圍擴大的新型病毒。這給布尼亞病毒診斷、預防及控制帶來了更大的困難，增加了對公共衛生的危害。據報道，在東非地區NRIV可導致人類嚴重的發熱性疾病。研究證據表明，NRIV是在BUNV和BATV同時感染同一宿主時，經天然基因重組而產生的一種新病毒。因為NRIV擁有BATV的M段，同時與BUNV的S和L段相結合［24］。BUNV引起人體輕微癥狀，如發熱、頭痛、關節痛和皮疹。兒童感染癥狀偏多，免疫功能低下的患者可能會發展為嚴重的腦炎。在家畜中，特別是反芻動物中，感染后會出現嚴重的癥狀如自然流產和致畸［25］。BATV引起人類輕度的流感樣疾病，但可使反芻動物產生嚴重的疾病，其表現為流產、早產和致命性出血熱。NRIV致病力與母本病毒相比顯著增強，它能引起人的致命性出血熱，臨床表現與RVFV類似。在1998-1999年的肯尼亞和索馬里及2010年毛里塔尼亞都有爆發［26］。

2011年，在德國和荷蘭首次發現SBV，家畜感染這種病毒后會產下畸形甚至是死胎。從發現后的一年時間席卷整個歐洲；2012-2013年間，在歐洲的27個國家都有發現，涉及8 000多個農場，嚴重威脅歐洲的畜牧業生產［27］。根據遺傳發育證據顯示，SBV與薩蘇伯里病毒、沙門達病毒在基因組序列上十分接近。SBV是這兩種病毒或突變的重組體。SATV和SHAV先后于1999年與2002年在日本發現，但兩種病毒感染動物后無明顯癥狀。SBV的致病能力明顯高于SATV和SHAV，并能造成嚴重的經濟損失。

5 展望

對于分節段基因組的病毒而言，基因重排和基因重組既是一種非常強大的進化壓力，促使其獲得許多關鍵的適應性突變，也是一種快速產生新病毒的方式，使其致病性增加、宿主范圍擴大。因此，基因重排本質上增大了布尼亞病毒對宿主的危害，從而對人類公共衛生造成了更大的威脅。盡管現有的布尼亞病毒重排研究工作為病毒間的相互作用研究提供了大量有效信息，但是在變異方向、變異頻率等方面仍存在許多未解之謎。所以，監測、研究病毒間、尤其是已知的可以感染哺乳動物的布尼亞病毒間的基因重排和重組的發生仍是研究的重點。

由于很多布尼亞病毒可借助媒介在宿主動物間傳播，要完全消滅這些病毒難度極大。基于傳統致弱減毒的疫苗也可能由于與自然界的野生型毒株發生遺傳交換而恢復或增加其致病性，目前也尚無可供使用的布尼亞病毒疫苗。因此，要對重要的布尼亞病毒進行深入研究，進一步探究病毒感染的遺傳決定因素、節肢動物在布尼亞病毒傳播中的作用、傳播介質阻斷病毒感染或傳播的機制以及驅動布尼亞病毒基因重排的內在機理，從而助推基因工程疫苗的開發及本病的免疫防控。