NO3-轉運蛋白在植物適應逆境中的功能研究進展

李曉婷 袁建振 汪芳珍 李仁慧 崔彥農 馬清

（蘭州大學草地農業科技學院 草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州 730020）

氮素（N）是植物必需的大量元素之一，是植物體內蛋白質、核酸及葉綠素等的重要組分，在植物生長發育過程中發揮著十分重要的作用，其供給的充足與否，直接影響著植物體內眾多物質和能量代謝活動，因此，被稱為生命元素［1-3］。氮素以多種形態存在于自然生態系統中，大氣中的氮主要以氮氣的形式存在，土壤中能被植物吸收利用的氮素則主要為硝態氮（NO3-）和銨態氮（NH4+）等無機氮及尿素、氨基酸等有機氮，也有少數一些豆科植物可與固氮菌形成共生關系進而利用大氣中的氮氣作為其氮素營養的主要來源［4］。在自然條件下，旱田土壤中NO3-的含量要遠高于NH4+。因此，在植物氮素吸收轉運機制方面的研究中，NO3-得到了學術界更多的關注［4-7］。NO3-不僅是植物的重要氮源，還可作為信號分子在打破種子休眠、調控側根發育、誘導葉片生長及調節相關基因表達等方面發揮關鍵作用［5，7］。植物對 NO3-的吸收和運輸主要通過兩種NO3-轉運系統完成，即低親和轉運系統（Low-affinity transporter system，LATS）和高親和轉運系統（High-affinity transporter system，HATS）。當外界的NO3-濃度低于0.5 mmol/L時，NO3-的轉運主要由高親和轉運系統負責執行；當外界NO3-的濃度高于0.5 mmol/L時，NO3-的轉運主要依賴于低親和轉運系統［5，8］。

植物根系對NO3-的吸收及NO3-在植株體內的轉運主要由NO3-轉運蛋白（Nitrate transporters，NRTs）介導［5，8］。近年來，已有眾多學者發現NRT家族成員蛋白不僅作為NO3-轉運體在植物NO3-的吸收和轉運過程中發揮重要作用，而且參與調控植物對多種逆境脅迫的抵御和適應過程。有關NRT類蛋白的結構特征及它們在植物正常生長發育過程中NO3-的吸收轉運中的功能已有一些綜述報道［9-13］，但有關NRT類蛋白在植物抵御和適應逆境脅迫過程中的作用尚未見系統性的總結。鑒于此，本文重點綜述了近年來關于NRT類蛋白在植物適應低NO-、3低K+、鹽、干旱及重金屬鎘等脅迫中重要作用的研究進展，以期為今后進一步深入探究植物抗逆機理提供依據和參考。

1 NO3-轉運蛋白在植物生長發育過程中NO3-轉運中的功能概述

高等植物中已發現的NO3-轉運蛋白主要包括NRT1（根據系統發生關系更名為NPF家族蛋白）和NRT2 兩類家族蛋白［5，8，14］。在模式植物擬南芥中，已發現50多個NRT1家族成員，其中10個成員功能已被研究清楚。

AtNRT1.1（AtNPF6.3）是植物中首個被克隆和鑒定的NO3-轉運蛋白［15］，其編碼基因主要在根的皮層及內皮層細胞中表達［16］。研究發現，AtNRT1.1是一種雙親和性NO3-轉運蛋白，可參與高親和與低親和性NO3-的吸收［5］。AtNRT1.2（AtNPF4.6）在擬南芥根表皮細胞中表達，介導根系低親和性NO3-的吸收［17］。AtNRT1.4（AtNPF6.2）主要在葉脈及葉柄細胞的液泡膜中表達，主要參與調控葉柄和葉片中NO3-的穩態平衡［18］。AtNRT1.5（AtNPF7.3）為低親和性NO3-轉運蛋白，主要在根中木質部周圍中柱鞘細胞的細胞膜上表達，介導NO3-向木質部的裝載及其向地上部的長距離運輸［19］；而定位在木質部薄壁細胞的AtNRT1.8（AtNPF7.2）參與介導木質部NO-3的卸載［20］，AtNRT1.9（AtNPF2.9）主要表達于根韌皮部伴胞，參與根系韌皮部NO3-的裝載［21］，這三者共同參與調節NO3-在根系和地上部的分配［20-21］。AtNRT1.6（AtNPF2.12）僅表達于角果的維管組織和胚珠的珠柄，且在植株授粉后其表達量顯著增加，該基因的主要功能是通過參與NO3-向胚胎的運輸而直接影響胚胎的早期發育［22］。AtNRT1.7（AtNPF2.13）在老葉的韌皮部細胞中表達，定位于質膜上，參與調控NO3-從老葉向新葉的轉運以實現NO3-的再利用［23］。而主要定位于葉片主脈韌皮部伴胞質膜上的AtNRT1.11和AtNRT1.12亦參與調節NO3-向新生幼嫩葉片的分配［24］。擬南芥NRT2家族有7個成員，它們主要介導高親和性NO3-的吸收，在可利用的硝酸鹽有限時被激活并發揮主導作用［5］。

2 NO3-轉運蛋白在植物適應逆境脅迫中的功能

2.1 NO3-轉運蛋白在植物適應低NO3-脅迫中的作用

植物對NO3-十分敏感，其供應不足會使葉片迅速黃化衰老［25］。大量研究表明，NRT2家族蛋白主要參與低NO3-脅迫下植物根系NO3-的吸收［5，26-29］。在擬南芥中，AtNRT2.1主要表達于擬南芥根的成熟區表皮、皮層和內皮層細胞，該基因突變后，外界低濃度NO3-條件下植株根系NO3-吸收能力下降50%-70%，因此，AtNRT2.1是低NO3-脅迫下介導植物根系NO3-吸收的主要功能蛋白［27］。進一步研究發現，低NO3-脅迫可顯著誘導AtNRT2.1的表達，一方面促進植株根系對NO3-的吸收；另一方面影響乙烯的合成及其信號轉導通路，進而調控植株對低NO3-脅迫的適應過程［27，30］。研究表明，AtNRT2.2突變后，低NO3-脅迫下植物根系NO3-的吸收能力僅下降19%，但當AtNRT2.1突變后，AtNRT2.2的表達豐度上調了3倍，表明AtNRT2.2是AtNRT2.1功能的一個補充者。AtNRT2.4屬于極高親和NO3-轉運蛋白，其編碼基因主要表達于側根的表皮細胞［28］。高濃度NO3-條件下，AtNRT2.4的表達量極低，但當外界NO3-的濃度降低時，其表達量隨著處理時間的延長持續增加［28］。在極低濃度NO3-（0.025 mmol/L）條件下，atnrt2.4突變體NO3-吸收速率明顯低于野生型，表明AtNRT2.4參與極低濃度NO3-脅迫下的NO3-吸收過程［28］。AtNRT2.5主要表達于根表皮和根 毛區皮層細胞，并受氮饑餓的顯著誘導；在低NO3-脅迫下，擬南芥atnrt2.5突變體NO3-的吸收能力顯著降低［29］，且同時敲除AtNRT2.1、AtNRT2.2、AtNRT2.4和AtNRT2.5中任意3個基因的突變體植株在低NO3-條件下的生長均受到顯著抑制［28-29］。可見，上述蛋白在低NO3-脅迫下植物根系NO3-的吸收過程中發揮著重要作用。

表1 NO3-轉運蛋白在植物響應逆境脅迫中的功能

除上述高親和性NO3-轉運蛋白外，植物中幾個低親和性NO3-轉運蛋白亦可參與介導低NO3-脅迫下植物根系NO3-的吸收。研究發現，AtNRT1.1是一種雙親和性NO3-轉運蛋白，其對NO3-的親和性隨土壤中NO3-濃度的不同而發生轉換，這一過程依賴于其氨基酸序列第101 位蘇氨酸殘基（Thr101）的磷酸化和去磷酸化：當Thr101發生去磷酸化后，AtNRT1.1表現出低親和性NO3-轉運蛋白活性；而當Thr101殘基被磷酸化后，AtNRT1.1則表現出高親和性NO3-轉運蛋白活性，參與低NO3-脅迫下根系NO3-的吸收過程［31］。Ho 等［32］發現，與CBL（B類磷酸酶蛋白）互作的蛋白激酶CIPK23可使AtNRT1.1的T101位點發生磷酸化，進而使AtNRT1.1表現出高親和性NO3-轉運活性。在水稻中發現有2個NRT1.1同源基因（OsNRT1.1a和OsNRT1.1b），外界高NO3-條件下，它們的超表達均會顯著增加植株體內氮素的累積，進而使得植株地上部干物質重量顯著增加。然而，只有OsNRT1.1b的超表達能顯著增加植株在低NO3-（0.125 mmol/L）環境下的氮素的累積，表明水稻OsNRT1.1b蛋白可參與低NO3-條件下水稻根系NO3-的吸收［33］。最新研究表明，在低氮的大田條件下，水稻OsNRT1.1a的超表達株系比野生型早熟9-13 d，且單株種子數、千粒重和分蘗數都多于野生型，從而使單株籽粒產量較野生型增加了32%-50%，因此，超表達OsNRT1.1a可有效提高氮素利用效率，增加低氮條件下水稻籽粒產量［34］。NRT1.1不僅參與NO3-的吸收，還可通過調控生長素在植物根中的分配進而調節植物的根系發育。

在低NO3-脅迫下，AtNRT1.1通過促進生長素的向基運輸，而使側根中生長素濃度降低，抑制側根生長；當NO3-濃度增加時，AtNRT1.1抑制生長素的向基運輸，側根中生長素濃度增加，促進側根生長［35］。另有研究表明，AtNRT1.1也可以感知外界較低濃度（0.05-0.50 mmol/L）的NO3-信號，緩解谷氨酸對植株主根生長的抑制，從而促進主根的生長［36］。

除NRT1.1外，低NO3-脅迫下NRT1.5也可通過調控植物葉片的衰老而影響植物的生長發育［37］。利用atnrt1.5單突變體和atnia1、atnia2、atnrt1.5三突變體對比研究表明，NO3-饑餓過程中atnrt1.5葉中NO3-的濃度高于三突變體，而三突變體老葉的衰老率反而低于atnrt1.5，因此，AtNRT1.5抑制葉片衰老的過程并不是通過影響NO3-轉運來實現的［37］。進一步分析發現，在NO3-饑餓時，atnrt1.5葉片中的K+水平會顯著降低，補充K+后葉片的衰老表型能基本得到恢復［37］。不僅如此，NO3-饑餓脅迫下atnrt1.5植株中與K+吸收相關的HAK5、RAP2.11及ANN1的表達量顯著下調，這表明NRT1.5可以通過感知NO3-饑餓的信號，進而促進葉片中K+的積累來抑制葉片的衰老［37］。另有研究發現，AtNRT1.5可參與介導木質部K+的裝載，與K+外整流通道SKOR共同調節不同的K+/NO3-條件下K+從根向地上部的長距離運輸，其中，SKOR主要在高NO3低K+時活性較高，而AtNRT1.5則在低NO3條件下發揮作用［38］。

2.2 NO3-轉運蛋白在植物適應低K+脅迫中的作用

K+是植物體內含量最豐富的陽離子，與植物體的正常發育及農作物的產量等密切相關，K+從根向地上部的運輸及在地上部的穩態平衡是植物保持營養平衡、維持正常生長和適應逆境環境的決定性因素之一［39-40］。大量研究發現植物體內NO3-和K+在吸收、轉運、再分配過程中都存在密切的聯系［41-42］。研究表明，AtNRT1.5的功能缺失會導致植株在低K+脅迫下表現出冠部提前發黃、根部持續生長的低K+敏感表型。同時，atnrt1.5突變體根部K+含量較野生型顯著升高，地上部K+含量較野生型顯著降低；而低K+脅迫下atskor突變體并未表現出明顯缺K+表型，其根冠內的K+含量也與野生型相比無顯著差異，且atnrt1.5/atskor雙突變體與atnrt1.5的表型一致［43］。進一步利用非洲爪蟾卵母細胞異源表達系統的分析表明，AtNRT1.5是K+/H+反向轉運蛋白，直接參與細胞K+外排［43］。由此可見，在低K+脅迫下AtNRT1.5可參與介導根部木質部薄壁細胞中K+向木質部的裝載，從而促進根部K+向地上部的運輸，緩解地上部因缺K+造成的脅迫損傷，并且此過程并不依賴于K+外整流通道SKOR［43］。然而有趣的是，Lin等［19］研究發現，低K+脅迫可顯著抑制擬南芥AtNRT1.5的表達，但該基因轉錄水平上的變化模式與AtNRT1.5蛋白參與調控低K+條件下K+從根部向地上部運輸的功能之間的關系有待進一步的研究。此外，除對地上部的影響之外，K+與植物根系的發育及形態結構也關系密切［41-42］。Zheng等［44］研究發現，在低K+且NO3-充足的條件下，atnrt1.5突變體植株的側根密度顯著減小，而側根的發育受生長素的影響。因此，推測NRT1.5參與調控K+饑餓條件下植物根系生長素的穩態平衡。

2.3 NO3-轉運蛋白在植物抵御鹽和干旱脅迫中的作用

氮素的吸收轉運在植物適應鹽和干旱逆境中發揮著重要作用［45-47］。Guo 等［48］發現，AtNRT1.1 參與調控植物的耐旱能力：在干旱脅迫下，擬南芥野生型植株葉片嚴重萎蔫黃化，而atnrt1.1突變體植株則葉片飽滿且保持綠色。這主要是因為AtNRT1.1也在擬南芥保衛細胞中大量表達，參與介導保衛細胞NO3-的吸收；當AtNRT1.1突變后，保衛細胞中NO3-的積累量較野生型顯著降低，進而降低氣孔開度，這有利于減少由蒸騰作用導致的水分散失，從而提高了植株的耐旱能力。Chen等［49］發現，在鹽和滲透脅迫（模擬干旱脅迫）下，擬南芥根中AtNRT1.5的表達豐度顯著下降；與野生型植株相比，鹽處理下atnrt1.5突變體木質部汁液中Na+含量顯著下降，植株地上部Na+含量降低而根中Na+顯著增加，使得atnrt1.5突變體耐鹽能力明顯增強；同時，與野生型植株相比，滲透脅迫下atnrt1.5突變體根和地上部抗旱相關功能基因P5CS1和RD29A的表達豐度顯著增加，進而使得atnrt1.5的抗旱能力也明顯強于野生型植株。可見，AtNRT1.5參與調節植株體內Na+的長距離運輸和空間分配，并影響逆境響應相關基因的表達，進而在擬南芥耐鹽抗旱性中起到“負調控”作用［49］。此外，主要定位于植物根系中柱鞘細胞的NO3-轉運蛋白NPF2.3可通過調控鹽脅迫下NO3-向木質部的裝載，從而有利于維持鹽脅迫下植株地上部NO3-的含量，進而在植物適應鹽脅迫的過程中發揮重要作用［50］。

2.4 NO3-轉運蛋白在植物抵御重金屬隔脅迫中的作用

鎘（Cd）是生物毒性極強的一種重金屬，且比其他重金屬更易被植物吸收積累［51］。研究發現，調控NO3-在植物體內再分配的NRT1.8編碼基因在Cd2+脅迫下的表達豐度顯著上調，且Cd2+處理顯著減少了NO3-由擬南芥根部向地上部的轉運；在Cd2+脅迫下，atnrt1.8突變體表現出較野生型敏感的表型，并且atnrt1.8突變體對Cd2+敏感的表型依賴于介質中NO3-濃度［20］。進一步分析發現，atnrt1.8地上部Cd2+含量顯著高于野生型，且atnrt1.8中Cd2+由根部向地上部轉運也增加，因此，NRT1.8可通過將Cd2+滯留在植物根部，進而減少地上部Cd2+的積累，從而在植物抵御Cd2+毒害的過程中發揮重要作用［20］。有趣的是，AtNRT1.5對Cd2+脅迫的響應模式與AtNRT1.8相反［49］，兩者可共同參與調節植物對Cd2+脅迫的適應。在Cd2+脅迫時，負責將NO-3從木質部卸載至根部的NRT1.8表達量上調，而負責NO3-木質部裝載的NRT1.5表達量下調，從而使更多的NO3-積累在植物根部以應對Cd2+脅迫［52］。此外，在許多的生物和非生物脅迫中AtNRT1.5和AtNRT1.8往往表現出相反的表達模式［20，53］，因此推測植物體內NO3-的分配可能參與調控植物對多種脅迫的響應［20，26］。近年來，已有學者對這一響應模式在生物化學及分子水平上做了解釋［52］。Cd2+等脅迫會激活植物乙烯（ET）信號途徑和茉莉酸（JA）信號途徑，使轉錄因子ERFs通過與AtNRT1.8啟動子結合而誘導其表達，同時使EIN3/EIL1直接與AtNRT1.5啟動子區域結合，抑制AtNRT1.5的表達，這兩者的反向表達有利于NO3-在根中的積累，從而調節植株的抗逆性與植株生長之間的平衡［52］。

3 總結與展望

NO3-轉運蛋白不僅介導植物正常生長發育過程中的NO3-的吸收和轉運，而且還參與調控植物對多種逆境脅迫的適應過程。雖然NO3-轉運蛋白在植物適應低NO3-、低K+、鹽、干旱及重金屬鎘脅迫中的重要作用已引起了學術界的關注，但對NO3-轉運蛋白在植物逆境適應過程中的作用機制仍不清楚。目前相關研究大多以模式植物擬南芥為材料，該植物抵御鹽和干旱等脅迫的能力十分有限，因此，以擬南芥為材料研究NO3-轉運蛋白在植物抗逆性中的作用機制存在一定的局限性。

此外，目前，學術界僅關注到NO3-轉運蛋白在植物適應上述幾種脅迫中的重要作用，但對其在植物適應其他脅迫中的功能仍不明確。鑒于此，今后的研究可從以下幾方面進行：（1）以具有極強抗逆能力的植物如鹽漬和荒漠生境中廣為分布的鹽生和旱生植物為材料，克隆NO3-轉運蛋白基因，利用CRISPR-Cas9、基因敲除、超表達等技術系統研究其調控活性及其在這些植物適應鹽和干旱等逆境中的生理功能和相關作用機制；（2）進一步深入研究NO3-轉運蛋白在植物適應低NO3-和低K+脅迫過程中的作用機制的同時，關注NO3-轉運蛋白在植物適應磷、鎂等其他重要營養元素虧缺條件中的功能。上述研究的完成可為進一步深入探究植物抗逆機理、篩選抗逆功能基因提供重要的理論依據。