抗鎘內生細菌阿耶波多氏芽孢桿菌的分離鑒定及生物學特性

劉軍生 解修超 羅陽蘭 鄧百萬 柏秋月 燕孟琛 白星

（1. 陜西理工大學 陜西省食藥用菌工程技術研究中心，漢中 723001；2. 陜西理工大學 生物科學與工程學院，漢中723001）

隨著工農業的發展，尤其是礦山開采和重金屬冶煉相關行業的快速發展，重金屬污染逐漸成為嚴重的生態問題［1］，已引起廣泛關注［2-3］。我國重金屬污染狀況不容樂觀［4］，尤其是礦山、尾礦庫區等地土壤和水體的重金屬污染更為嚴重，再加之過度的開采，導致礦區土地退化，生物多樣性銳減［5］，土地生產力喪失，出現礦區石漠化等現象［6］。鎘（Cd）作為土壤中主要的重金屬污染物之一，因移動性大、毒性高而受到廣泛重視。據統計，我國鎘污染土壤面積已達20萬km2，并有進一步擴大的風險［7］。另外，土壤中的鎘極易被植物吸收，通過食物鏈富集進而危害人體健康［8］。因此，土壤的鎘污染治理迫在眉睫。

微生物因其具有比表面積大、繁殖迅速、代謝能力旺盛、種類多、適應性強及成本低等優勢，在鎘污染治理中的具有重要地位［9］。目前，耐鎘微生物的篩選已受到眾多專家學者的關注。已分離篩選到的耐鎘微生物主要為Pseudomonassp.、Cupriavidus metallidurns、Bacillus cereus、Enterococcus faecalis、Sphingomonassp.等［10］。Zhang 等［8］分 離到的Lactobacillus plantarumCCFM8610菌株耐鎘能力極強，可達1 000 mg/L，Cd2+吸附率可達31.34%。Limcharoensuk等［11］篩選到的P. aeruginosaB27可吸附16.89 mg/g 的Cd2+，應用潛力巨大。劉玉玲等［12］分離的耐鎘細菌Delftia acidovoransB9能夠促進污染土壤中的Cd從弱酸可溶態向可還原態和殘渣態轉化，為Cd污染土壤微生物修復提供了理論依據。

阿耶波多氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai），簡稱阿氏芽孢桿菌，分布廣泛［13］，在動物腸道［14］、植物根際［15］、深海［16］、高原［17］均有發現，抗逆性極強。其應用主要有兩方面，一是降解或合成某種大分子化合物等，二是與植物共生或者促進植物生長等［18］。目前，阿氏芽孢桿菌在植物促生和抗逆方面已有報道，但對該菌作為內生細菌在Cd污染修復方面的報道相對較少。

本研究從秦嶺鉛鋅尾礦區采集優勢植物杠柳并從中分離出一株鎘耐受性濃度為900 mg/L 的內生細菌，并進行分子生物學鑒定，研究其生物學特性，包括培養條件對菌株生長的影響，菌株的Cd2+去除率、鉛鋅耐受性、促生能力以及對小麥幼苗抗鎘能力的促進作用，以期為該菌株在環境鎘污染修復中的應用提供理論依據，提高環境修復效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣地點 供試的杠柳（Periploca sepium Bunge）于2017年3月采自陜西省漢中市略陽縣（東經106°16'，北緯33°34'）。剪取健康植株的根和莖，用封口袋帶回實驗室，24 h內進行內生細菌的分離。

1.1.2 試劑 細菌基因DNA提取試劑盒購自上海生工生物技術有限公司，其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器 EYELA N1000型旋轉蒸發儀（上海愛郎儀器有限公司），SW-CJ-1D型單人超凈工作臺（上海蘇凈實業有限公司），YXQ-LS-50S型高壓滅菌鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），UV2550型紫外分光光度計（日本島津公司），A320原子吸收分光光度計（上海精密儀器有限公司）。

1.1.4 培養基 牛肉膏蛋白胨固體培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，H2O 1 000 mL（液體培養基不加瓊脂）。

無機磷培養基：葡萄糖 10.0 g、（NH4）2SO40.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、Ca3（PO4）210.0 g、蒸餾水1 000 mL、瓊脂20.0 g。

解鉀細菌培養基：鉀長石2.5 g，Na2HPO40.2 g，MgSO47H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35.0 g，葡萄糖10.0 g，CaSO47H2O 0.1 g。

1.2 方法

1.2.1 抗鎘內生細菌的分離與鑒定 將杠柳的根和莖依次用75%酒精（30 s）、0.1%升汞（8 min）、10%次氯酸鈉溶液（1 min）消毒，并用組織印跡法［19］進行消毒可靠性檢驗。將根和莖分別研磨后稀釋3個梯度做3個重復，分別涂布于Cd2+濃度為100 mg/L 固體培養基上，置于37℃恒溫培養箱中暗培養72 h，之后以100 mg/L 為梯度進行濃度梯度篩選，以最終篩選的出能在Cd2+濃度為900 mg/L 的培養基上生長的一株內生細菌GR42作為實驗材料。

1.2.2 菌株菌落及細胞形態 在牛肉膏蛋白胨培養基上培養，觀察菌落的形態、邊緣、顏色和透明度等，采用革蘭氏染色法觀察菌體的形態和大小。

1.2.3 生理生化實驗 甲基紅實驗、V-P 實驗、檸檬酸鹽實驗、吲哚實驗、H2S產生實驗、石蕊牛乳實驗、氧化酶實驗、酶觸實驗、尿酶實驗、糖發酵實驗、硝酸鹽還原實驗、淀粉水解實驗等參考《常見細菌系統鑒定手冊》［20］。

1.2.4 抗鎘內生細菌16S rDNA的序列分析 利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，采用細菌通用引物1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）和 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 對 16S rDNA序列進行擴增。將分離得到的抗鎘內生細菌菌株進行16S rDNA分子鑒定并將PCR產物送上海生工測序，測序結果整理后提交NCBI，申請并獲得登錄號，利用Mega7.0構建系統發育樹。

1.2.5 菌株的生長曲線 取抗性菌株接種于50 mL液體牛肉膏蛋白胨培養基中，置37℃下振蕩（140 r/min）培養，分別于 0、4、8、12、24、36、48、60、72、84和96 h，取樣測定OD值，并繪制生長曲線。

1.2.6 培養條件對菌株生長的影響

1.2.6.1 溫度對菌株生長的影響 取抗性菌株接種于50 mL液體牛肉膏蛋白胨培養基中，分別置于23、28、33、和37℃下振蕩（140 r/min）培養36 h，取樣測定OD值。

1.2.6.2 pH對菌株生長的影響 取抗性菌株分別接種于50 mL 初始pH為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和10.0的牛肉膏蛋白胨培養基中振蕩（140 r/min）培養36 h，取樣測定OD值。

1.2.6.3 裝液量對菌株生長的影響 取抗性菌株接種于250 mL三角瓶中裝液量分別為25、50、100和150 mL的牛肉膏蛋白胨培養基中振蕩（140 r/min））培養36 h，取樣測定OD值。

1.2.6.4 NaCl濃度對菌株生長的影響 取抗性菌株接種于50 mL NaCl濃度分別為1、5、10、30和50 g/L的牛肉膏蛋白胨培養基中振蕩（140 r/min）培養36 h，取樣測定OD值。

1.2.7 抗性菌株對Cd2+的去除率 測定方法參考金忠民等［21］，用原子吸收分光光度法測定Cd2+濃度。取活化后菌懸液進行去除實驗。初始實驗條件設定為：恒溫水平搖床轉速為140 r/min，接種量為2%，pH 7.0，培養溫度為37℃，培養基初始Cd2+濃度分別為100、200、400、600和800 mg/L，同時做空白對照。培養36 h后將培養液10 000 r/min 離心10 min除去菌體，取上清液過0.22 μm濾膜用于測定Cd2+濃度，以不含菌但含100 mg/L Cd2+的培養基為對照，去除率按下列公式計算：

式中：C0為Cd2+的初始濃度（mg/L），C為Cd2+的殘留濃度（mg/L）。

1.2.8 抗性菌株對鉛鋅的耐受性 分別配制只含Pb2+濃度為 400、800、1 200、1 600、2 000、2 400和3 000 mg/L 的液體牛肉膏蛋白胨培養基和只含Zn2+濃度為 400、800、1 200、1 600、2 000、2 400和3 000 mg/L 的液體牛肉膏蛋白胨培養基，分別向每瓶接種抗性菌株GR42，置37℃下振蕩（140 r/min）培養36 h后取樣測定OD值。

1.2.9 菌株促生能力研究

1.2.9.1 IAA（吲哚-3-乙酸）活性 測定方法參考姜云等［22］Salkowski比色法，分別測定菌懸液OD600值和離心后上清液OD530值，計算菌濃度OD600值為1時，單位體積菌懸液中細菌分泌IAA的量。標準曲線采用分析純的IAA梯度稀釋后，以IAA濃度為橫坐標，以OD530值為縱坐標繪制。根據標準曲線方程計算菌懸液中IAA的含量。

1.2.9.2 鐵載體活性 測定方法參考分光光度計法，用鐵載體活性單位（Siderophore units，SU）表示鐵載體的產量，根據公式計算菌株產鐵載體的量：

式中，Ar為空白參比值，As為處理參比值。

1.2.9.3 ACC（1-氨基環丙烷-1-羧酸）脫氨酶 測定方法參考韓坤等［23］ACC脫氨酶活性的測定方法并作部分調整。用比活力（U/mg）即單位酶活除以總蛋白濃度表示ACC脫氨酶活性。

1.2.9.4 溶磷解鉀 采用透明圈法［24］進行定性實驗；通過鉬銻抗比色法及四苯硼酸鈉法進行溶磷解鉀定量實驗，具體操作步驟見參考文獻［25-26］。

1.2.10 菌株對鎘脅迫小麥幼苗的促生作用 將菌株GR42接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于恒溫水平搖床轉速140 r/min，37℃條件下培養36 h后，10 000 r/min，離心5 min，將菌體重懸于無菌水中備用。

將珍珠巖置于組培瓶中，加入含Cd2+的Hoagland營養液，使珍珠巖中的Cd2+終濃度為10 mg/kg，滅菌后將消毒過的小麥種子置于組培瓶的砂床上，每瓶10粒種子，置3個重復，恒溫培養15 d，分別在第5天和第10天加入10 mL不同的菌懸液，以無菌水為空白。15 d后測其生理指標，包括株高、根長、鮮重、干重、葉綠素和可溶性糖及可溶性蛋白。

2 結果

2.1 菌株細胞形態觀察及生理生化實驗

從陜西漢中礦區采集的杠柳中分離得到1株在Cd2+濃度為900 mg/L 的培養基上生長的鎘抗性內生細菌GR42，該菌株在平板上的生長情況及革蘭氏染色情況，如圖1所示。革蘭氏染色為紫色，菌株GR42為革蘭氏陽性菌。

圖1 菌株菌落形態

通過菌株的形態觀察及生理生化實驗結果可以看出，GR42的菌落形態為圓形、乳白色、邊緣整齊且透明度差。該菌株為革蘭氏陽性菌，細胞形狀為桿狀，長寬比3.8，糖發酵實驗、甲基紅實驗、檸檬酸鹽實驗、H2S產生實驗、脲酶實驗、氧化酶實驗、觸酶實驗、淀粉水解實驗均呈陽性。V-P實驗、吲哚實驗、硝酸鹽還原實驗均呈陰性。可分解石蕊牛乳產酸，符合芽孢桿菌屬菌株的生理生化特性。

2.2 菌株16S rDNA序列鑒定結果

通過平板培養法篩選出1株在900 mg/L Cd2+濃度平板上生長的內生細菌GR42，其序列大小在1 500 bp左右。將GR42菌株16SrDNA序列測序后，進行序列分析和相似性比較，并建立系統發育樹以確定該菌的系統分類地位。結果（圖2）顯示該菌株與Bacillussp. 中的Bacillus aryabhattai具有99%的相似性，結合形態觀察及生理生化實驗結果，鑒定此菌株為阿耶波多氏芽孢桿菌，登錄號為MF919465。

圖2 菌株GR42的系統發育樹

2.3 菌株的生長曲線

細菌的生長曲線是描述細菌生長特性的重要指標，對細菌的發酵有一定的指導意義。由圖3可見，菌株GR42在接種0-8 h內處于延遲期；在8-36 h內處于對數生長期；36-48 h 處于穩定期；48 h之后，菌株進入衰亡期。可見菌株的對數生長期較長，穩定期較短，這可能與菌株特異性和培養基成分有關。

圖3 菌株生長曲線

2.4 培養條件對菌株生長的影響

2.4.1 溫度對菌株生長的影響 溫度是影響微生物新陳代謝的重要指標之一。由圖4可以看出，該菌株最適宜的培養溫度在28-33℃之間。在28℃之前隨著溫度的升高菌株的生長速率升高，而超過33℃菌株的生長速率降低。

圖4 溫度對菌株生長的影響

2.4.2 pH對菌株生長的影響 pH可以反應出菌株對于環境的適應能力，不同的菌株對于pH的要求不盡相同。由圖5可以看出，菌株GR42對pH的適應范圍近似于以pH7.0為期望值的正態分布圖，其最適的pH在7.0左右，在pH6.0-7.5范圍內生長良好，但不能在強酸或強堿的環境中生長。

圖5 pH對菌株生長的影響

2.4.3 裝液量對菌株生長的影響 微生物在不同生長階段對氧氣需求量不同，對發酵產量有直接影響，因此研究溶氧量對于微生物發酵有重要意義。以250 mL三角瓶中不同裝液量來考察溶氧量對菌株GR42發酵的影響。如圖6所示，在140 r/min 搖床轉速下，隨著裝液量從25 mL增加到150 mL，菌體生物量表現出下降趨勢，說明菌體生長對溶氧的需求較大，最適裝液量為50 mL。

圖6 不同裝液量對菌株生長的影響

2.4.4 NaCl濃度對菌株生長的影響 在高鹽環境之下，由于Na+作用的細胞會失水皺縮，影響生長，因此培養基中的鹽濃度對細菌的生長十分重要。不同微生物對滲透壓的適應能力不盡相同，由圖7可以看出，GR42菌株隨著鹽濃度的增大，菌株的生長速率逐漸受到抑制。菌株GR42在鹽濃度為1-5 g/L之間時均能生長，有較強的抗鹽脅迫能力，其最適鹽濃度在5-10 g/L之間，當鹽濃度達到50 g/L時對細菌的正常生長有一定的抑制作用。

圖7 鹽濃度對菌株生長的影響

2.5 菌株對鎘的去除率

菌株對重金屬離子的去除率是衡量菌株修復能力的重要指標。利用原子吸收分光光度法測定溶液中剩余Cd2+的含量，計算菌株GR42對不同濃度Cd2+的去除率，去除效果見圖8。可見隨著鎘濃度的升高菌株對Cd2+的去除率逐漸降低，去除率與菌株OD600值呈正相關關系。這是由于Cd2+對菌株的生長有毒害作用，濃度越高毒害作用越大，使得菌株單位時間內OD600值變小，群體數量的減少導致去除率降低。

2.6 菌株對鉛鋅的耐受性

鎘抗性菌株GR42不僅對Cd2+具有較高抗性對鉛鋅也有較高抗性，由圖9可以看出在鉛鋅耐受性實驗中，GR42菌株對 Pb2+的耐受性明顯優于Zn2+；隨著Pb2+、Zn2+濃度的增加，菌株的生長呈現先增加后降低的趨勢，這可能與一定濃度Pb2+、Zn2+的對菌株的生長有一定的促進作用有關。當Pb2+濃度為1 600 mg/L 時，GR42生長最好，而當Pb2+濃度大于1 600 mg/L 時，菌株的生長明顯受到抑制，2 000 mg/L 時菌株不生長；當Zn2+濃度為1 200 mg/L 時，菌株GR42生長最好，當大于1 200 mg/L 時，菌株GR42的生長受到明顯抑制。

圖8 菌株GR42對不同濃度鎘的去除率

圖9 菌株鉛鋅耐受性

2.7 促生能力研究結果分析

以 SU 作為定量指標，值越大鐵載體的產量越大。如表1所示，菌株 GR42 所測得 SU 值為76.74%。同時菌株GR42對Cd2+也有較高的去除率，這說明鐵載體在菌株抗鎘性能方面有重要作用。ACC脫氨酶活性為0.627 U/mg。菌株GR42培養液中有效磷含量為85.43 mg/L，溶磷量為13.801 mg/g，有效鉀含量為30.15 mg/L，解鉀量為8.868 mg/g。

2.8 對鎘脅迫小麥幼苗的促生作用研究

鎘對小麥幼苗有嚴重的毒害作用使得其生長發育受到抑制，植株矮小，葉片泛黃等，由表2可見，與空白組相比添加菌株GR42處理的小麥幼苗的株高、根長、鮮重、干重和葉綠素含量都有顯著增加，可溶性糖和可溶性蛋白含量差異不顯著，這可能與菌株GR42吸附了部分游離態的鎘，使小麥根際周圍Cd2+的濃度降低，使得鎘脅迫壓力變小有關。同時該菌株還可以產生鐵載體和ACC脫氨酶促進小麥幼苗的生長。可見，菌株GR42可有效提高鎘脅迫下小麥幼苗的生物量，促進其生長。

3 討論

植物內生菌（Endophyte）是生活史的部分或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官間隙內，并與之建立和諧聯合關系的各種不同微生物，內生菌在與植物的協同進化過程中會獲得宿主植物的部分遺傳基因序列，具有產生與宿主植物相同或相似代謝產物的能力［27］，部分內生菌可產生吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、鐵載體和 1-氨基環丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）脫氨酶等促進植物的生長。 在細菌的代謝過程中，鐵元素可作為激活劑 和催化基團，在酶的作用過程中起到非常重要的 作用［28］。產ACC脫氨酶的細菌可以通過抑制植物體內乙 烯合成的胞內聚合酶，將乙烯合成前體ACC分解為α-丁酮酸和氨，從而促進自身和宿主植物的生長［29］。磷、鉀是植物生長所必需的營養元素，不僅參 與許多重要的生命代謝活動，而且還是很多器官的 組成成分，對作物碳水化合物的運輸、合成和分解 起著重要作用。土壤中雖含有豐富的磷、鉀元素， 但由于大部分磷、鉀以難溶性鹽或氧化物的形式存 在于土壤中，導致植物無法直接吸收利用［30］，溶 磷解鉀微生物可將礦物態磷鉀轉變為可以被植物吸 收的有效磷、有效鉀，可為植物及其他微生物提供 磷源磷，在土壤磷、鉀素循環中起著至關重要的作 用［31］。經鑒定本研究從杠柳中分離篩選出的抗鎘內生細菌為阿耶波多氏芽孢桿菌，鐵載體活性76.74%，ACC脫氨酶活性0.627 U/mg，溶磷量為13.801 mg/g，解鉀量為8.868 mg/g。聶孝紅等［32］從銻礦周邊污染土壤中篩選出4株可產生IAA和鐵載體的耐銻細菌，可促進油菜在中低濃度銻污染下株高、根長和葉綠素含量的增加。王東升等［33］從龍葵根際土中篩選出的定銅綠假單胞菌T1和陰溝腸桿菌Y2 可向胞外分泌有機酸活化土壤中難溶態的磷和鎘元素，促進龍葵對磷鎘元素的吸收，促進龍葵的生長。以上研究結果這與本研究結果相一致，菌株GR42可有效提高鎘脅迫下小麥幼苗的生物量，促進其生長，表明其既有重金屬抗性，又有促生能力。

表1 鎘抗性內生細菌促生能力研究結果

表2 菌株對鎘脅迫小麥幼苗的促生作用

菌株GR42的最適溫度、pH、裝液量和鹽濃度分別為28℃、7.0、50 mL/250 mL和5-10 g/L。Cd2+濃度為800 mg/L 時，鎘去除率可達41.1%，可耐受2 000 mg/L Pb2+、1 200 mg/L Zn2+。 汪 嬋 娟 等［34］從有色金屬礦區植物根際土壤中分離出3株抗鎘細菌分別為S. echinoides、Massilia flava和阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）對Cd2+的最低抑菌質量濃度分別為300、100和 80 mg/L，本研究從鉛鋅礦區植物中分離出的內生細菌GR42也是一株阿氏芽孢桿菌，可在800 mg/L Cd2+水平生長，具有更高的鎘抗性。瞿佳等［35-36］分離出的糞產堿菌（Alcaligenes faecali）在Pb2+濃度為0.5和1.0 mmol/L 時，去除率分別為99.08%和97.24%，不解糖假蒼白桿菌對Zn2+的最大耐受濃度20 mmol/L，在Zn2+濃度為2.0 mmol/L 時吸附率高達55.25%。本研究分離的內生細菌GR42在Cd2+濃度為600 mg/L 時，去除率為68.5%，同樣有較高的鎘抗性和鉛鋅抗性，這可能與其較高的鐵載體活性和過氧化氫酶活性有關，表明該菌株在鎘污染修復方面有潛在的應用價值。

阿氏芽孢桿菌作為21世紀初發現的一種分布廣泛、功能多樣、應用潛力巨大的新興細菌，近年國外研究大多傾向于大分子降解、產物合成及促進植物生長等。阿氏芽孢桿菌RS1［37］可產生植酸酶水解磷酸鹽，阿氏芽孢桿菌31SG［38］代謝產生的丙烯酰胺水解酶可以水解丙烯酰胺和丙烯酸鉀復合物，這與本研究的結果一致，其具有溶磷解鉀的能力，可見阿氏芽孢桿菌在降解大分子化合物、保護環境方面應用潛力巨大；Aneesh等［39］從土壤中分離的阿氏芽孢桿菌PHB10代謝產生的聚羥基丁酸酯（Polyhydroxybutyrate，PHB）具有優良的物理屬性，為利用細菌生產PHB的應用提供了理論基礎；阿氏芽孢桿菌還能提高植物抗逆性，緩解砷、銅、鋅和亞硝酸鹽對植物的毒害作用，分泌植物激素等促生物質促進植物的生長［18］。Singh等［40］將阿氏芽孢桿菌NBRI014在濃度1 000 mg/L 的砷酸鹽培養基中培養后發現，菌株能夠吸收砷元素，降低環境中砷的毒性。阿氏芽孢桿菌SRB02［41］可降低土壤中亞硝酸鹽對大豆的毒害作用。Bhattacharyya等［42］發現阿氏芽孢桿菌AB211可溶解無機磷酸鹽，合成鐵載體，并產生吲哚乙酸等激素促進植物生長，這與本實驗中菌株可產生鐵載體并促進小麥幼苗生長結果一致。可見，本實驗中分離的阿氏芽孢桿菌既有重金屬抗性，又有促生能力，表明該菌株在植物促生和鎘污染修復方面有潛在的應用價值。

本實驗尚有不足，仍需進行后續研究，如未對菌株Cd2+去除特性進行研究，未進行鉛鋅鎘復合污染下菌株去除3種重金屬的動力學實驗，未測定小麥幼苗中Cd2+含量，未測定小麥收獲后石英砂中殘留Cd的形態和含量，這一系列的問題都需要進行下一步實驗來解決。

4 結論

經鑒定抗鎘內生細菌GR42為阿耶波多氏芽孢桿菌，最適培養條件為溫度28℃、pH7.0、裝液量50 mL/250 mL和鹽濃度在5-10 g/L之間。該菌株鉛鋅鎘抗性和鎘去除率均較高，并有一定的促生能力，對小麥幼苗的抗鎘能力有顯著促進作用。該菌株可在植物促生和Cd污染修復方面具有一定的應用價值。