秸稈降解菌的篩選及其纖維素降解性能的研究

于慧娟 郭夏麗

（鄭州大學化工與能源學院，鄭州 450000）

據報道我國的秸稈年產量位居世界第一。秸稈中含有豐富的有機質及氮、磷、鉀、鎂、鈣和硫等農作物生長必需的營養元素，充分發揮和利用秸稈還田的積極效應，對促進農作物生長和養分資源的高效利用具有重要意義。有研究表明，長期秸稈還田，能增加土壤有機質，改善土壤理化性狀。并且可以減少農業生產造成的污染，實現秸稈資源化利用［1-3］。小麥成熟后，其秸稈中纖維素含量明顯增高，可高達51.16%［4］，經處理后在農業方面可用做肥料、飼料、生活燃料及食用菌基料等。如何加速秸稈纖維素的降解是提高秸稈在農業方面利用率的關鍵。

纖維素酶在秸稈降解過程中起著至關重要的作用。1906年，Seilliere在蝸牛的消化液中發現纖維素酶，可以分解天然纖維素［5］，人們相繼開展了利用微生物對作物秸稈進行降解的研究。自然界中存在大量能夠產生纖維素酶的真菌和細菌，20世紀40年代以來，眾多研究者已篩選出大量纖維素降解菌，主要包括木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、漆斑霉屬（Myrothecium），毛殼霉屬（Chaetomium）等，為篩選秸稈降解菌提供了重要參考依據［6-10］。利用這些微生物處理纖維素具有纖維素分解效率高、無污染的特點，這類微生物資源經分離篩選和馴化后一般對人畜無害、可提高生物轉化效率并且作用條件溫和。本實驗主要從森林中的腐殖土、小草的根際土壤還有食用桑葉的蠶蛹糞便中進行篩選。

眾多研究者在篩選纖維素降解菌時多采用剛果紅染色法，但剛果紅染色法會造成菌落之間混雜以及假陽性等現象，故本實驗在篩選菌株時首先采用秸稈粉篩選培養基進行篩選，以秸稈粉作為唯一碳源考察菌株的生長情況，后用剛果紅染色法進行進一步篩選，以期更直接快速地篩選出理想菌株。將篩選得到的菌株液體培養，測定小麥秸稈降解率以及纖維素酶活，探究菌株的纖維素酶活與秸稈降解之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種篩選樣品來源 菜田土、小草根際土、蠶糞及森林土。

1.1.2 培養基 （1）赫奇遜氏（Huchinson）無機鹽培 養 液 ：KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，CaCl20.1 g，FeCl30.01 g，蒸餾水1 000 mL。（2）羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養基：CMC-Na 15 g，瓊脂20 g，赫奇遜氏無機鹽培養液1 000 mL。（3）秸稈粉平板培養基：小麥秸稈80℃烘干至恒重，粉碎過100目篩。小麥秸稈粉10 g，瓊脂粉20 g，赫奇遜氏無機鹽培養液1 000 mL。（4）濾紙平板培養基：赫奇遜氏無機鹽培養液中添加瓊脂粉20 g/L，待菌種轉接至培養基后，立刻鋪一片無菌扇形濾紙片在培養基上。（5）液體產酶培養基：小麥秸稈粉20 g，赫奇遜氏無機鹽培養液1 000 mL。（6）秸稈降解培養基：小麥秸稈烘干剪成1 cm左右的段狀，段狀秸稈20 g，赫奇遜氏無機鹽培養液1 000 mL。（7）生物量測定培養基：CMC-Na 15 g，赫奇遜氏無機鹽培養液1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離與純化 稱取10 g樣品接入90 mL無菌水中，恒溫震蕩箱（28℃、120 r/min）中震蕩30 min，取樣品懸液，用無菌水稀釋成 10-1、10-2、10-3的濃度梯度，吸取稀釋濃度為10-3的稀釋液，涂布于秸稈粉平板培養基中［11］，置于28℃的恒溫培養箱中培養5 d，根據在以秸稈粉為唯一碳源的培養基中菌落的直徑（即生長速度）來評估菌株對秸稈的降解利用情況，選取直徑較大的菌株進行分離純化并保存。將純化好的菌株分別點種在羧甲基纖維素鈉培養基上，28℃下培養4 d，用1 g/L 剛果紅染液染色20 min，棄去染液，加入1 mol/L NaCl溶液，洗滌20 min 后測量菌落直徑和透明圈直徑，分別用D和 H來表示。根據透明圈直徑和菌落直徑比值大小初步判斷菌株產纖維素酶的能力，選取比值大的菌株進行下一步研究［12-14］。

1.2.2 秸稈降解 將純化保存的菌株分別轉接至平板，培養5 d后，用無菌水制成菌懸液，分別取5 mL菌懸液接種于每瓶秸稈降解培養基中，置于恒溫（28℃、120 r/min）震蕩培養箱中培養。10 d后將秸稈取出，用蒸餾水沖洗，再用稀酸溶液沖洗，以去除其上附著的菌體和CaCO3沉淀等，再用蒸餾水沖洗3次，80℃烘干至恒重，以失重法計算秸稈降解率。

W0：初始秸稈干重；Wt：培養t時間后秸稈干重。

1.2.3 濾紙腐解 將菌株轉接至赫奇遜氏無機鹽培養基后，把滅菌后的扇形濾紙平鋪至平板中。28℃下培養7 d，觀察濾紙的腐爛程度。

1.2.4 纖維素酶活的測定 纖維素粗酶液的制備：制備每株菌株的菌懸液（方法同1.2.2），接5 mL菌懸液入產酶培養基，置于恒溫震蕩（28℃、120 r/min）培養箱中培養，分別于1、2、3、5、6、9、12和15 d取培養液過濾，濾液即為制備的粗酶液。

內切酶活（endo-1，4-β-D-glucanase，EG/Cen）的測定：取4支帶有刻度的試管，編號后分別加入1.5 mL的0.5% CMC-Na溶 液（0.5 g CMC-Na定容到100 mL 0.05 mol/L，pH4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中）作反應底物并提供緩沖環境，0.5 mL粗酶液，其中1號試管中加入2 mL DNS以鈍化酶活性，作空白對照。4支試管同時放入水浴鍋中50℃保溫30 min。保溫反應后，立刻取出，并向2、3、4號試管中加入2 mL DNS以終止反應，搖勻后沸水浴10 min，之后冷卻至室溫并用蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。以1號試管的溶液為空白對照調零點，在540 nm波長下測定2、3、4號試管溶液的吸光值［15］。葡萄糖標準曲線的繪制參見農業行業標準NY/T9122004［16］，根據每次測定的葡萄糖量，計算出相應的酶活力。

外切酶活（exo-1，4-β-D-glucanase，CBH/Cex）的測定：用50 mg脫脂棉作為反應底物，加入1.5 mL的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（0.05 mol/L，pH4.8），代替內切酶活測定過程中CMC-Na溶液，其余操作一致。

β-葡萄糖苷酶活（β-1，4-glucosidase，β-Gase）的測定：用1.5 mL 1%的水楊苷溶液作為反應底物代替內切酶活測定過程中CMC-Na溶液，其余操作一致。

酶活單位（U/mL）定義為：50℃下，每毫升酶液在上述反應條件下1 min內催化底物水解生成 1 μmol 葡萄糖所需的酶量。

纖維素酶活力（U/mL）=（m×1000×n）/（M×V×t）。m：反應過程中產生葡萄糖的量（mg）；n：粗酶液稀釋倍數；M：葡萄糖分子質量（μg /μmol）；V：反應體系中粗酶液的體積（mL）；t：反應時間（min）。

1.2.5 生物量的測定 根據干重法測定不同菌株的生物量。

2 結果

2.1 菌種的篩選

2.1.1 菌種的初篩 挑選可以在以秸稈粉為唯一碳源的秸稈粉培養基長勢較好和H/D較大的菌株。在秸稈粉平板中篩選得到5株菌株，編號為z-5、4-1、3-1、2-2、m-2。其中z-5菌落直徑最大，在剛果紅染色實驗的結果中，菌株z-5的H/D位居第二，達到16.2 mm，透明圈比較明顯，具有較大的研究潛力（表1）。

表1 不同菌株的H/D

2.1.2 小麥秸稈降解率的測定 本實驗篩菌的主要目的是篩選秸稈降解菌，故對菌株的秸稈降解率進行考察。將5株真菌分別接入秸稈降解培養基中，置于28℃，120 r/min下震蕩培養10 d，測得小麥秸稈降解率如圖1所示。

綠色木霉是目前已知的纖維素酶活較高的菌株，常被應用于農作物秸稈的降解中，因此以綠色木霉為參考菌株。由圖1可知，5株真菌的秸稈降解率均高于綠色木霉。其中菌株z-5和菌株4-1的降解率最高，分別為47%和45%，其次是菌株3-1、菌株2-2和菌株m-2，分別為32%、31%和29%。在相同的秸稈降解條件下，綠色木霉的小麥秸稈降解率最低，為20%左右，菌株z-5的降解率是綠色木霉的2倍以上。

圖1 不同菌株的小麥秸稈降解率

2.2 不同菌株的濾紙腐解情況

將秸稈降解率高于30%的4株菌株分別涂布轉接至濾紙培養基中培養7 d，結果如表2所示。其中菌株z-5和菌株4-1對濾紙的降解能力最強；菌株3-1和菌株2-2次之，實驗結果與小麥秸稈降解率實驗的結果相似。

表2 不同菌種對濾紙的降解能力

2.3 不同菌種纖維素酶活的測定

將4株真菌進行液態培養，分別測定它們在不同時期的外切葡聚糖酶活，內切葡聚糖酶活和β-葡萄糖苷酶活。

在整個培養過程中，菌株4-1、2-2和z-5的內切葡聚糖酶活均呈現先增后降的趨勢，而菌株3-1的內切葡聚糖酶活呈現逐漸增加的趨勢（圖3）。菌株4-1和z-5的內切酶活在第3 天達到最大，分別為56 U/mL和49 U/mL；而菌株2-2內切酶活在第5天達到最大值，為76 U/mL。菌株3-1的內切酶活在第15天時達到14.62 U/mL。

圖3 不同菌株的內切葡聚糖酶活

菌株4-1、菌株2-2和菌株z-5的外切葡聚糖酶活變化趨勢與它們的內切葡聚糖酶活變化趨勢相似，即先增后降（圖4）。在第3天時3個菌株的外切酶活均達到最大，分別為43 U/mL、58 U/mL和54 U/mL。第3-9天，菌株z-5與菌株2-2的外切酶活值接近。第9天至第15天，菌株z-5的外切酶活均大于菌株2-2。菌株3-1外切酶活在整個培養期中一直呈增長趨勢，在第15天達到10 U/mL。

圖4 不同菌株的外切葡聚糖酶活

菌株4-1、菌株z-5和菌株2-2的β-葡萄糖苷酶活變化與它們的內、外切葡聚糖酶活變化趨勢相似，即先增后降（圖5）。菌株z-5和菌株4-1的酶活在第3天達到最大，分別為47 U/mL和59 U/mL，菌株2-2在第5天達到最大，為76 U/mL，其中菌株2-2的酶活峰值最大。在第9天，3個菌株的酶活值接近。在第9-12天，菌株z-5酶活下降不明顯，而菌株2-2和4-1均有明顯下降，其中菌株2-2下降幅度最大。菌株3-1的β-葡萄糖苷酶活隨著培養時間延長不斷增加，第9天后增加幅度加大，第15天達到了60 U/mL。

圖5 不同菌株的β-葡萄糖苷酶活

2.4 不同菌株生物量的比較

比較4個菌株的生物量發現，培養10 d時菌株z-5的生物量最大，其次是菌株3-1和菌株4-1，菌株2-2的生物量最小，表明菌株z-5生長速率最大，菌株2-2生長速率最小（表2）。菌株2-2的內切酶活與外切酶活峰值均是菌株3-1相應酶活峰值的5倍以上，但兩者的秸稈降解能力相似。在相同的培養條件下，菌株2-2的生物量僅為菌株3-1的約1/4，兩者生物量差異顯著（P＜0.05）。由此推測較低的生物量可能是造成菌株2-2秸稈降解率偏低的因素之一。

表3 不同菌株的生物量

3 討論

秸稈的主要成分是纖維素，纖維素是葡萄糖以β-1，4糖苷鍵結合形成的高分子化合物，包括葡萄糖單位2 000-10 000個，濾紙是聚合度中等的纖維素材料。本實驗中所篩選菌株的濾紙腐解結果與它們的秸稈降解結果相似，即菌株z-5和菌株4-1降解能力較高，而菌株3-1和菌株2-2較低。同時，通過對木質素降解酶系即木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶等酶活的測定，未發現這些菌株具有木質素降解酶活（數據未呈現），表明本實驗所篩選的秸稈降解菌具有降解秸稈纖維素的能力，但不具有降解秸稈木質素的能力。同時說明濾紙的腐爛程度能較好地反映出菌株的纖維素降解能力。

外切葡聚糖酶作用于纖維素鏈的末端，產生纖維二糖。內切葡聚糖酶作用于纖維素內部的非結晶區，水解纖維素分子內部的β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子打斷，為外切葡聚糖酶提供更多的還原端或非還原端。β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子。該3種酶的合理搭配能夠有效分解纖維素為葡萄糖。在纖維素酶活的檢測中發現，所篩選菌株均具有3種纖維素降解酶，纖維素酶種類較為齊全，但它們的纖維素酶活的變化趨勢卻不完全相同，其中菌株3-1的3種纖維素降解酶活在實驗過程中逐漸加大，其他3株菌的3種纖維素酶活均為先增后降。菌株z-5和菌株4-1的3種酶活峰值均出現在同一天，而菌株2-2的3種酶活峰值出現在不同時間內。菌株2-2的3種纖維素酶活的峰值均為最高，但秸稈降解率卻不是最高，這與王洪媛和范丙全［17-18］研究結果不同。推測原因有二：其一，菌株2-2的內切酶活和β-葡萄糖苷酶活峰值均出現在第5天，外切酶活峰值則出現在第3天，3種酶的協同性較低。其二，菌絲的匍匐生長可破壞秸稈的致密結構，菌株2-2的生長速率較低，導致破壞秸稈結構作用減弱，因此秸稈降解率最低。菌株z-5的3種酶的協同性較高，而且生長速率快，菌絲的蔓延對秸稈結構能產生一定破壞作用，促進相應酶與底物接觸，由此秸稈降解率最高。雖然菌株4-1的生長速率低于菌株3-1，但在秸稈降解的10 d內，菌株4-1的3種酶活均高于菌株3-1，由此菌株4-1的秸稈降解率高于菌株3-1，表明纖維素酶的作用在秸稈降解中起著主導作用。

4 結論

從土樣中分離純化出4株高效秸稈降解菌，經初步鑒定4株菌株皆為真菌，測定所得菌株的纖維素酶活、濾紙腐爛情況和小麥秸稈降解率。其中秸稈降解效果最好的為菌株z-5，10 d內秸稈降解率可達47%，并且菌株z-5酶系種類齊全，濾紙腐解試驗與小麥秸稈降解實驗結果相似。