外源PBZ和GA3對太子參發育過程內源IAA積累及其相關基因表達的影響

鄭偉 周濤 江維克 李軍 肖承鴻 楊昌貴 張晨 龔安慧韋德群 畢艷

（1. 天津中醫藥大學研究生院，天津 300193；2. 貴陽中醫學院，貴陽 550025）

吲 哚 -3-乙 酸（Indole-3-acetic acid，IAA） 是植物體內主要的內源生長素（Auxin），參與調控植物生長發育的各個生命活動，如根初期發育與形態建成、維管束形成與分化及器官衰老等。目前，認為IAA生物合成途徑根據是否依賴色氨酸可分為2條，其中依賴色氨酸途徑一般劃分色胺（Tryptamine，TAM）途徑和吲哚-3-丙酮酸（Indole-3-pyruvate，IPA）途徑等4條［1］。在植物體內，IAA的生物合成以TAM途徑和IPA途徑最為普遍。隨著研究的不斷深入，學者們研究認為TAM途徑的一個限速酶和催化IPA途徑的一個限速步驟均是YUCCA基因［2-6］。然而IAA在植物體內有游離態和結合態2種類型，其中具有活性的是游離態，而結合態可經水解降解成游離態。GH3編碼的吲哚乙酸氨基化合成酶能催化IAA氨基化，導致IAA失活，進而維持植物體內IAA含量穩定［7］。可見，YUCCA和GH3對合成和調控植物體內的內源IAA動態平衡具有重要意義。

太 子 參Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm系石竹科植物，入藥部位為干燥塊根，因其藥性甘、微苦且平，具有益氣健脾、生津潤肺的功效，是臨床常用的補益中藥。目前市場上太子參藥材主要來自江蘇句容、安徽宣州、福建柘榮和貴州施秉等地區的栽培品，其種植過程塊根的生長發育情況是影響藥材品質的重要因素。近年來，關于太子參塊根形成與膨大的研究已有報道［8-11］，研究顯示太子參塊根是由不定根發育而成，要經歷不定根的發育和塊根形成2個階段，之后則是塊根不斷膨大階段。而多效唑（Paclobutrazol，PBZ）為含氮雜環化合物，是一種植物生長延緩劑，具有抑制營養生長，進而促進生殖生長，達到增加產量與改善品質等作用。鄭聽等［12］研究表明使用適量濃度的PBZ能夠提高太子參的產量。但未見從外源PBZ和內源IAA結合的角度對太子參塊根生長發育進行研究的報道。

本研究以貴州施秉常用種源為實驗材料，研究外施PBZ以及與PBZ有拮抗作用的赤霉素（Gibberellin，GA）的活性成分GA3對太子參塊根形成后的膨大階段的影響，旨在闡明外源PBZ對內源IAA含量的影響。同時，從Illumina平臺測序構建的太子參轉錄組數據庫中檢索、鑒定和克隆太子參YUCCA和GH3，以期探明外源PBZ對IAA生物合成的相關基因YUCCA和GH3表達模式的影響，為太子參栽培提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年4月底，將生長健壯、長勢一致的貴州施秉種源太子參幼苗移栽至含混合土（普通土∶營養土∶珍珠巖∶蛭石=3∶3∶1∶1）的塑料花盆中（30 cm×30 cm），盆下墊水盤，每盆6-7株，根據土壤表面濕潤程度于每日傍晚19：00左右在葉面噴施適量清水。1周以后，太子參幼苗逐漸有新葉長出，選擇長勢優良均勻的幼苗隨機分成4個組，每組重復3次，分別用200 mL 20 mg/L PBZ、150 mg/L GA3及GA3+PBZ（V/V=1:1）澆灌太子參根際土壤，以等量清水為對照組，進行掛牌標記；次日同一時段用200 mL營養液澆灌太子參根際土壤；均為每隔10 d澆灌1次。

樣品材料為第1次激素處理后，第10、20、30、40和50 d進行采挖，選取大小均勻的塊根經液氮速凍，置-80℃保存，處理后10-50 d的材料用于提取內源IAA，10、30和50 d的材料用于提取總RNA。其中第一次采樣（處理后10 d）是太子參塊根膨大初期，最后一次采樣（處理后50 d）是太子參植株在倒苗后10 d左右［13］。

1.2 方法

1.2.1 內源IAA提取與含量測定 根據酶聯免疫吸附測定法試劑盒提供的操作方法提取處理后第10、20、30、40和50 d實驗材料中的內源IAA，并測定其含量。

1.2.2 總RNA提取與cDNA第一鏈合成 參照試劑盒RNAiso Plus和DNaseⅠ的操作說明對第10、30和50 天的太子參塊根總RNA進行提取純化，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，微量核酸測定儀檢測其濃度和純度并調節至800 ng，以OligoT11（50 μmol/L）為引物，SMART MMLV Reverse Transcriptase為反轉錄酶合成第一鏈cDNA，-20℃保存備用。

1.2.3 太子參IAA合成相關基因的鑒定與克隆 以擬南芥和水稻的YUCCA和GH3家族成員核苷酸序列為query序列，借助Local BLAST-2.2.24+軟件在太子參轉錄組數據庫中進行同源比對分析，然后通過在線工具NCBI Blastn再一次進行分析。去除重復的序列后，運用在線數據庫SMART、NCBI CDSearch和Pfam對候選基因進一步確認，獲得太子參YUCCA和GH3家族基因。同時，對確認的YUCCA和GH3在太子參不同組織器官中的轉錄表達豐度進行分析，并根據每個基因對應的序列設計特異引物（表1），以太子參塊根cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系為Premix Taq（Ex Taq Version 2.0 plus dye）12 μL、 上 下 游 引 物（10 μmol/L） 各 1 μL、cDNA模板1 μL，滅菌雙蒸水補足到25 μL。擴增程序為98℃ 10 s；退火溫度 30 s，72℃ 2 min，35個循環；4℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后與pMD19-T連接，轉化至大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。

1.2.4 太子參發育過程中IAA生物合成相關基因的表達分析 根據上述鑒定確定的3個GH3和1個YUCCA的CDS序列設計實時熒光定量PCR的特異性引物（表1），分別以外源PBZ和GA3處理后10、30和50 d太子參塊根的cDNA為模板，太子參PhACT2（GenBank登錄號為KT363848）為內參基因［14-15］，對IAA生物合成相關基因在經外源PBZ和GA3處理后太子參塊根中的表達模式進行檢測。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒在ABI公司的7500 Real Time PCR System進行實時熒光定量PCR擴增。PCR擴增體系為2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）10 μL、50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 0.48 μL、cDNA 模板 2 μL，加 ddH2O補至20 μL。每個反應生物學重復3次，操作重復3次。擴增程序為 95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40 個循環。溶解曲線為 95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。用 2-△Ct法對各基因相對表達量進行分析。

表1 實驗所用的引物

1.2.5 數據分析 采用GraphPad Prism 5軟件對數據進行處理和繪圖，應用SPSS 16中單因素方差（Oneway ANOVA）分析對各組數據進行多重比較。

2 結果

2.1 外源PBZ、GA3處理對太子參塊根中內源IAA含量的影響

如圖1所示，太子參塊根生長發育過程內源IAA的含量在第一次處理后10-20 d表現為下降，之后的含量基本穩定，維持在8-10 ng/g FW。根際土壤灌注20 mg/L PBZ溶液10、20和30 d后，根內源IAA含量均明顯高于對照組，隨后均低于對照，而處理10 d時內源IAA含量最高。而當太子參植株根際土壤灌注150 mg/L GA3溶液時，其內源IAA含量發生不同程度的改變，除在20 d時低于對照外，其他幾個時期均高于對照，其中10 d時最高。有趣的是，在太子參塊根形成后膨大的整個時期，4個實驗組內源IAA的含量在處理后10 d均為最高，之后逐漸下降，到30 d之后基本保持動態平衡。

2.2 太子參IAA生物合成相關基因的鑒定與克隆

利 用 Local BLAST、SMART、NCBI CD-Search和Pfam方法，從太子參轉錄組數據庫中鑒定獲得3個GH3，序列為1 103-2 364個核苷酸長度；1個YUCCA，序列為974個核苷酸長度（表2）。以太子參塊根cDNA為模板，利用特異引物擴增所得的目的條帶大小與預期大小一致（圖2）。通過分析太子參轉錄組中的轉錄表達數據（圖3），Unigene43146、Unigene37777和Unigene43412這3個GH3的表達模式相似，均在太子參塊根的韌皮部和木質部中表達量最高，且均高于葉、莖和花；但編碼YUCCA的Unigene49937的表達模式表現出相反趨勢，具體為花＞葉＞塊根韌皮部＞莖＞塊根木質部。

2.3 外源PBZ、GA3對IAA合成相關基因轉錄表達的影響

為了進一步探討外源PBZ和GA3對內源IAA生物合成的影響，采用實時熒光定量PCR技術檢測IAA生物合成相關基因表達的變化，進而分析對基因表達模式的影響（圖4）。

表2 太子參IAA生物合成相關基因的篩選和鑒定

圖2 太子參IAA生物合成相關基因cDNA擴增產物的電泳檢測

圖3 太子參IAA生物合成相關基因在不同組織的表達分析（n=3）

第1次激素處理后10 d時，外源PBZ處理組，Unigene37777受PBZ誘導表達量表現為上調，Unigene43146和Unigene43412的表達均無明顯變化；外源GA3處理組，Unigene37777和Unigene43412這2個GH3表達量也明顯上調。然而，YUCCA的Unigene49937的表達量在外源PBZ和GA3處理組均表現為下調。

30 d時，外源PBZ處理組，Unigene43146和Unigene37777的轉錄表達水平與對照組相比無顯著變化，但下調了Unigene43412的表達和上調了Unigene49937的表達；有趣的是，在外源GA3處理組，除Unigene43146的表達水平無顯著變化外，Unigene37777、Unigene43412和Unigene49937在 受GA3誘導后的相對表達量均呈現顯著上調。

50 d時，外源PBZ處理后，GH3除Unigene-37777受PBZ誘導表達量表現為上調外，Unigene-43146和Unigene43412的表達受到抑制，并且表達量有不同程度的降低。然而外源GA3處理后3個GH3表達量均明顯上調。另外，YUCCA的Unigene49937的表達量在外源PBZ和GA3處理后表現截然相反的情況，受PBZ誘導，表達量顯著增強，而受GA3抑制，表達量略微下調。

3 討論

植物生長發育過程中，IAA是一種必需激素，參與調控器官建成、器官發育、維管組織分化、細胞伸長、頂端優勢和根的向地性等多個過程。本研究表明，外源PBZ和GA3處理對內源IAA均有增強效應，特別是在太子參塊根膨大發育前期IAA含量尤為高，隨后IAA含量基本呈現同樣的下降趨勢，并趨于動態平衡。這與植物中IAA的合成主要集中在處于快速細胞分裂器官的研究結果相一致［16］。說明IAA是太子參塊根膨大初期生長發育的關鍵內源激素之一，但對塊根膨大中后期的影響不大。然而，外源PBZ和GA3對太子參塊根中內源IAA的合成都具有一定的促進作用，可能與它們都是植物生長調節劑有關。

IAA在塊根發育各階段的調控作用又受到其生物合成相關基因轉錄表達的影響。實時熒光定量PCR結果顯示在第1次激素處理后的第50天時，外源PBZ能降低Unigene43146和Unigene43412的表達水平，而提高Unigene37777的表達水平；同樣在對照組和外源GA3處理組3個基因表達水平也呈現為高低不一的情況，這3個GH3表達水平的各不相同，可能對催化自由態IAA向結合態轉化的能力也不相同，最后通過整合作用參與塊根成熟期IAA動態平衡的調節作用。

圖4 太子參IAA生物合成的相關基因YUCCA和GH3在不同激素處理塊根中的表達分析（n=3）

本研究還發現YUCCA和GH3在太子參各組織中的表達水平各不相同，其中Unigene43146、Unigene37777和Unigene43412塊根韌皮部和木質部特異性表達，Unigene49377的特異性表達則在花和葉。這可能是因為IAA的合成具有組織特異性［17］，是經特定細胞合成后再運輸到不同組織部位［18-19］。因此推測IAA對太子參塊根的膨大發育有著直接的調控作用，它的分布與濃度也直接影響塊根膨大發育。

4 結論

外源PBZ對太子參塊根膨大發育階段前期和中期的內源IAA積累表現出顯著的誘導作用，后期則是抑制作用，這均與YUCCA和GH3的轉錄表達水平密切相關。