大麥單粒種子起源的小孢子培養再生頻率研究

郭桂梅,何 婷,劉成洪,高潤紅,徐紅衛,李穎波,黃劍華,王亦菲,陸瑞菊

(上海市農業科學院生物技術研究所/上海市農業遺傳育種重點實驗室，上海 201106)

遠緣雜交是向栽培品種導入優異基因的有效方法，但雜交成功率、結實率均較低。遺傳背景相同的純合群體可以大幅度減少來自供試材料引起的試驗誤差，但是，其構建費時、費力。源于單粒種子的小孢子培養高頻再生技術可以有效克服上述難題。

大麥小孢子培養技術已日趨成熟[1-2]，大量再生綠苗的獲得為加快大麥育種進程和相關的機理分析提供了有利條件。陸瑞菊等[3-4]建立了大麥大田取材高效的小孢子培養體系；郭桂梅等[5]建立了溫室單粒種子分蘗穗高效形成技術。影響游離小孢子培養效率的因素復雜、繁多，對小孢子培養的供體植株、取材時期、前期預處理、誘導培養基、分化、植株再生等諸多方面均有研究報道[2]。有關單株培養的效率研究還未見報道。

本研究以大麥花30經小孢子培養獲得的加倍單倍體株系為供試材料，在已有研究基礎上[3-9]，于可控的人工氣候室中，研究離體穗預處理時間、離體小花預處理時間和誘導培養基中無機氮、有機氮含量以及添加PEG對愈傷組織產量、綠苗產量和再生能力的影響，為稀缺大麥資源的種質繁殖和創造同一親本來源的群體遺傳材料提供途徑，以更好地開展相關遺傳機理研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為大麥(HordeumvulgareL.)品種花30經小孢子培養獲得的加倍單倍體株系(編號6-3)的7株小孢子再生植株(編號6-3-1、6-3-4、6-3-6、6-3-7、6-3-10、6-3-20、6-3-23)及6-3-6的4株小孢子再生植株(編號6-3-6-2、6-3-6-4、6-3-6-10、6-3-6-11)。

1.2 方法

1.2.1 植株培養與取材

11株材料用盆缽種植于人工氣候室，光照強度25 μmol·m-2·s-1，光暗比12/12，溫度22 ℃/18 ℃,濕度70%。參照郭桂梅等[5]的方法，調節水、肥、溫度等，促進植株分蘗，以獲得足夠多的穗子進行小孢子培養。選取穗中部小花小孢子發育處于單核早期、中期的穗子，剪去葉片(保留上部兩片葉子基部約1.5 cm)，濕紗布包裹放入保鮮袋中，標號，5 ℃冰箱低溫處理。

1.2.2 小孢子培養

將1.2.1中低溫處理的穗子參照陸瑞菊等[10]和Lu等[4]方法進行小孢子游離。接種時，穗子的滅菌參照郭桂梅等[11]方法。每個試管接5個穗子的花苞，加入12 mL提取液(60 g·L-1甘露醇、1.1 g·L-1CaCl2、0.976 g·L-1MES、20 mg·L-1秋水仙堿，pH 5.8，下同)，用高速分散器以15 000 r·min-1旋切，150目篩網過濾，濾液700 r·min-1離心5 min，重復3次，收集小孢子。收集到的小孢子用提取液于25 ℃暗處理2 d后，用21%麥芽糖純化；誘導培養基洗滌1次，用其將小孢子密度調節至1.0×105個·mL-1。取1.0 mL小孢子懸浮液接種于培養皿(35 mm×12 mm)中，Parafilm封口，25 ℃暗培養19 d后將誘導培養基吸干，稱重愈傷組織；然后將其轉入分化培養基，25℃、12 h光照培養，待再生苗長至3 cm左右進行綠苗數目統計。正常的誘導培養基以N6為基本培養基，其中，KNO3和(NH4)2SO4含量降低一半[KNO3降低至1 415 mg·L-1，(NH4)2SO4降至231.5 mg·L-1]，鐵鹽加倍，并添加90 g·L-1麥芽糖、0.5 mg·L-1KT、1.0 mg·L-12,4-D、0.976 g·L-1MES、400 mg·L-1谷氨酰胺及100 mg·L-1水解干酪素，pH 5.8。分化培養基是以2/3MS為基本培養基，添加30 g·L-1麥芽糖、0.5 mg·L-16-BA、1.5 mg·L-1KT及0.05 mg·L-1NAA，用5.5 g·L-1瓊脂粉固化， pH 5.8。提取液和誘導培養基為過濾滅菌，分化培養基為0.11 Mpa、121 ℃高溫高壓滅菌15 min。

1.2.3 愈傷組織產量、綠苗產量和再生能力的條件優化

將不同單株(6-3-4、6-3-6、6-3-10、6-3-23)的離體穗進行不同時間(19 d 和32 d)的5℃低溫預處理后進行小孢子培養(同1.2.2)；將不同單株(6-3-10、6-3-20、6-3-23)的離體小花用提取液5 ℃預處理0 d、1 d和2 d后進行小孢子培養(同1.2.2)，測定其產生的愈傷組織產量、綠苗產量和再生能力，研究低溫預處理時間和離體小花提取液預處理時間對愈傷組織產量、綠苗產量和再生能力的影響。

將6份單株材料(6-3-1、6-3-4、6-3-6、6-3-7、6-3-20、6-3-23)的穗子按照1.2.2方法置于5 ℃冰箱預處理19 d進行小孢子培養，誘導培養基分為正常培養基和1/2無機氮培養基，其中后者是在正常誘導培養基的基礎上將KNO3和(NH4)2SO4再降低一半[KNO3降低至707.5 mg·L-1，(NH4)2SO4降至115.75 mg·L-1]；愈傷組織稱重后放入相同的分化培養基進行分化，統計綠苗產量。同時將其中的4份單株材料(6-3-4、6-3-7、6-3-20、6-3-23)的小孢子置于1/2無機氮培養基和添加了1 600 mg·L-1谷氨酰胺及400 mg·L-1水解干酪素的1/2無機氮培養基上(有機氮提高4倍)進行培養，統計愈傷組織產量、綠苗產量和再生能力， 研究無機氮和有機氮對愈傷組織產量、綠苗產量和再生能力的影響。

將4份單株材料(6-3-6-2、6-3-6-4、6-3-6-10、6-3-6-11)的小孢子置于正常誘導培養基和添加了4%PEG的培養基上進行培養，分化培養基同1.2.2，統計愈傷組織產量、綠苗產量和再生能力，研究PEG對此三個指標的影響。

1.2.4 測定項目及方法

愈傷組織產量：每皿小孢子培養19 d時產生的愈傷組織量，用mg·皿-1表示； 綠苗產量：每皿愈傷組織分化出的綠苗數，用株·皿-1表示；再生能力：每100 mg愈傷組織分化出的綠苗數，用株·100 mg-1愈傷組織表示。

1.3 數據處理

采用Excel 2010、DPS V7.05進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 離體穗5 ℃處理時間對愈傷組織產量、綠苗產量及再生能力的影響

從表1可以看出，單株6-3-10預處理32 d的愈傷組織產量和綠苗產量高于預處理19 d，而其他3份單株都是預處理19 d的效果優于32 d，其中，6-3-4和6-3-6差異達顯著水平。低溫預處理時間從19 d增加到32 d，所有供試單株的再生能力均下降，4份供試單株中，3份單株的再生能力在處理間差異顯著。6-3-23變幅最大，預處理19 d 時的愈傷組織產量、綠苗產量和再生能力分別是預處理32 d的1.41倍、6.75倍和4.75倍。

* 和 ** 分別表示預處理32 d與19 d間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

* and ** mean significant difference between the pretreatments at 19 d and 32 d at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

2.2 離體小花提取液預處理時間對愈傷組織產量、綠苗產量及再生能力的影響

從表2可以看出，提取液預處理時間對6-3-20的愈傷組織產量無顯著影響，對其綠苗產量、再生能力及其他材料的愈傷組織產量、綠苗產量和再生能力均有顯著影響，且均隨著處理時間的延長而增加(6-3-10的愈傷組織除外)，不同處理間差異均達顯著水平(6-3-10除外)。單株6-3-10的離體小花培養的愈傷組織與綠苗情況見圖1A和B。

同行數據后不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。表3～5同。

Different letters following data in same row mean significant difference between treatments at 0.05 level.The same in tables 3-5.

2.3 誘導培養基中無機氮含量對愈傷組織產量、綠苗產量及再生能力的影響

從表3可以看出，6份單株材料經低無機氮的誘導培養基處理后，愈傷組織產量、綠苗產量和再生能力均高于對照，其中，3份單株材料的愈傷組織在處理間差異顯著；6份材料的綠苗產量在處理間差異均顯著，增加幅度最大的是6-3-20(圖1C)，達到8.63倍，增加幅度最小的6-3-23，為1.53倍。5份材料的再生能力在處理間差異顯著。這些結果表明，誘導培養基中無機氮的降低，有利于胚性愈傷組織的形成，使得更多的愈傷組織能夠在分化培養基上形成綠苗。

2.4 誘導培養基中有機氮含量對愈傷組織產量、綠苗產量及再生能力的影響

從表4可以看出，誘導培養基中有機氮含量提高后，4份單株材料的愈傷組織產量和綠苗產量均顯著增加，再生能力在處理間差異不顯著；綠苗產量與愈傷組織產量的提高幅度相當。推測有機氮的提高使得更多的小孢子脫分化啟動形成愈傷組織(圖1D)，進而增加綠苗的數量。

A和B：小花預處理0 d、1 d、2 d的愈傷組織與綠苗；C：對照與處理(1/2無機氮)綠苗長勢；D：對照與處理(增加有機氮)愈傷組織。

A and B:Callus and green plants with floret nursing in extraction buffer；C:Green plants in normal and low inorganic nitrogen；D:Callus in normal and high organic nitrogen.

圖1大麥單株小孢子培養的愈傷組織與植株分化

Fig.1Callusgreenplantofbarleymicrosporeculturefromsingledonorplant

表3 無機氮對愈傷組織產量、綠苗產量及再生能力的影響Table 3 Effect of inorganic nitrogen on callus yield,green plantlet yield and regeneration capacity

表4 有機氮對愈傷組織產量、綠苗產量及再生能力的影響Table 4 Effect of organic nitrogen on callus yield,green plantlet yield and regeneration capacity

2.5 誘導培養基中添加PEG對愈傷組織產量、綠苗產量及再生能力的影響

從表5可以看出，PEG的添加對供試單株的愈傷組織產量影響不盡相同，除單株6-3-6-10降低外，其余3株均提高，但僅6-3-6-2提高顯著；PEG的添加使所有單株的綠苗產量均提高，且除單株6-3-6-4外均達顯著水平；所有單株的再生能力在添加PEG后均顯著提高。

表5 PEG對愈傷組織產量、綠苗產量及再生能力的影響Table 5 Effect of the addition of PEG on callus yield,green plantlet yield and regeneration capacity

3 討 論

在早期的花藥培養研究中，離體穗的低溫預處理和花藥的甘露醇預處理被廣泛應用于大麥花藥培養。雖然直接游離大麥小孢子也能獲得再生植株[12]，但是離體穗的低溫預處理有助于游離小孢子的脫分化啟動[13-15]，甘露醇(提取液主要成分)預處理的培養效果也得到證實[16]。這種簡單易行且非常有效的預處理方法在大麥、青稞和水稻的小孢子培養上同樣被廣泛采用[7,17-18]。本研究以大麥小孢子培養的單株為取材對象，比較了離體穗5 ℃處理19 d和32 d的培養效果，發現離體穗經過19 d的低溫預處理后，小孢子更容易啟動脫分化程序，且形成的愈傷組織質量好，具有更大的綠苗分化潛力，但這種效果會隨著供試單株不同而有所差異。小花或未成熟子房的共培養，可以促進小孢子胚胎的發生[4,19-20]。本研究發現，在小孢子游離前用提取液預處理小花1～2 d，也可以促進小孢子胚胎的發生，進而促進愈傷組織的形成和綠苗的分化。

培養基的選擇是植物離體培養中最能體現人為調控作用的因素之一，培養基中氮源的重要性在大麥花藥培養上早已證實。早期的工作以MS培養基和略作修改的MS培養基最普遍，后來N6、C17和W14培養基的發明及應用極大地推動了禾本科植物組織培養和花藥培養的進步[21-22]。將MS培養基中NH4NO3含量降低至165 mg·L-1對大麥花藥培養的成功至關重要[23]，培養基中無機氮源的影響在大麥小孢子培養上早已證實[7,9,24]。但有機氮的作用有爭議，有研究認為，培養基中添加谷氨酰胺會使白苗的數量大幅度增加[25]；谷氨酰胺的添加對水稻愈傷誘導具有基因型的選擇，而且不能夠提高植株的再生頻率[26]。也有研究表明，培養基中添加谷氨酰胺能夠促進水稻愈傷的誘導以及綠苗再生[27]；水解干酪素的添加能夠提高大麥花藥培養中綠苗率，降低白苗的數量[28]。本研究結果表明，適當降低誘導培養基中無機氮含量[KNO31 415～707.5 mg·L-1，(NH4)2SO4231.5～115.5 mg·L-1]，能顯著提高單株小孢子培養綠苗產量，誘導培養基中有機氮源含量提高，可以大幅度提高大麥小孢子離體培養的愈傷組織產量，從而提高綠苗產量。

PEG作為滲透脅迫物質可以對植物造成水分脅迫，因而被廣泛應用于植物抗旱性鑒定研究。有研究表明，在誘導培養基中加入較低濃度的PEG(80～100 mg·L-1)，可以提高小麥花藥培養的出愈率，PEG濃度達到120 mg·L-1時對供試材料的花藥出愈起到脅迫作用，在小麥的花藥培養中，供試材料整株水平的抗旱性與細胞水平的抗旱性存在著內在的關系[29-30]。小孢子培養必須采用液體培養方式，而通氣差是液體培養的致命缺點。為了改善液體培養基中的通氣條件，有研究表明，誘導培養基中添加Ficoll能提高綠苗得率[31]，不過Ficoll比較貴，在以育種為目的的小孢子培養中不常使用。我們在本試驗中觀察到，誘導培養基中添加了4%的PEG后，培養的小孢子很多呈漂浮狀態，而對照培養基中小孢子一般都下沉在培養皿的底部。因此，推測PEG的作用類似Ficoll，通過改善通氣條件使得愈傷組織的質量有了提高，從而提高了愈傷組織的綠苗再生能力，使綠苗產量有了大幅度提高。