2014-2016年四川盆地小麥白粉病菌毒性分析

徐 志，王 勝，張重梅，張 英，姬紅麗，倪健英，周益林，彭云良

(1.四川省農業科學院植物保護研究所/農業部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室,四川成都 610066; 2.四川省農業廳植物保護站,四川成都 610041; 3.中國農業科學院植物保護研究所,北京 100193; 4.四川省甘孜藏族自治州農業科學研究所,四川康定 626000)

小麥白粉病是由禾谷布氏白粉菌小麥?；?Blumeriagraminisf. sp.tritici)引起的一種氣傳病害，在全世界各主要麥區廣泛分布和危害[1]。自20世紀70年代末以來，該病害在中國的發生范圍不斷擴大，危害程度不斷加重，已成為小麥生產上的最重要病害之一[2]。四川省位于中國大陸西南腹地，東部為川東平行嶺谷和川中丘陵，中部為成都平原，西部為川西高原，小麥生長環境差異大，種植結構多樣化。小麥白粉病菌既能在川西北盆緣地區越夏，又能在成都平原越冬[3-5]。病菌無性和有性世代交替繁殖，在長期的進化與選擇中，形成了其獨特的群體結構[6]。選育和利用抗病品種是控制該病害最經濟有效的措施。但由于新毒性基因的產生及優勢小種的變化，品種抗病性極易喪失。及時監測該地區病菌群體毒性的演化，探索群體遺傳變異，對于制定更為有效的病害控制方法具有重要的意義。本研究利用26個單基因鑒別品種(系)，對來自四川盆地不同地區189個菌株進行苗期毒性測定和分析，以期為四川省小麥抗白粉病育種和品種布局提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 小麥白粉病菌菌株

2014-2016年在四川盆地小麥產區采集小麥白粉病菌閉囊殼標樣，采用司權民[7]的方法進行閉囊殼釋放和單孢子堆分離純化，獲得試驗菌株189個，其中位于盆地西部郫縣、新都、廣漢和綿陽游仙、鹽亭、安縣、江油分離的菌株數分別為54、44、19個和6、36、10、5個，位于盆地東部敘永、內江市中區、閬中、蒼溪和巴中分離的菌株數分別為2、2、6、1和4個。

1.1.2 小麥白粉病菌鑒別寄主

小麥白粉病菌繁殖品種Chancellor、26個單基因鑒別寄主品種(系)(表1)，均由中國農業科學院植物保護研究所提供。

1.2 試驗方法

將純化后的試驗菌株分別接種到健康的Chancellor一葉一心盆栽幼苗上，玻璃罩隔離培養，頂端5層紗布封口以防止雜菌污染；18 ℃的恒溫室中，16 h光照培養，繁殖菌種。5～7 d后，將26個單基因鑒別品種(系)，播種于30 cm×20 cm×5 cm的搪瓷方盤內，以感病小麥品種Chancellor作為對照，套上透明塑料袋，在18 ℃恒溫室中隔離培養。當第一葉片完全展開后，采用抖接法接種繁好的白粉菌分生孢子,每個菌株接種一套鑒別寄主[7]。待對照品種Chancellor完全發病后，參照盛寶欽[8]0～4級法，記載第一葉片的反應型。其中，1～2型為抗病反應，菌株表現為無毒性；3～4型為感病反應，菌株表現為有毒性。

1.3 數據統計分析

依據各菌株對各鑒別寄主的毒性譜，確定其毒性類型[9]。其中，特有毒性類型是指檢測頻率僅為1次的毒性類型，共有毒性類型是指兩個及其以上菌株含有的相同毒性類型。

根據毒性測定結果，將無毒性的菌株(0～2型)記為“0”，有毒性的菌株(3～4型)記為“1”，構建“0-1”毒性矩陣，計算毒性基因頻率，并統計每個菌株所含有的毒性基因數(即毒性復雜度)。毒力頻率=有毒力的菌株數/供試菌株總數×100%。

基于“0-1”毒性矩陣，以Popgene1.32軟件[10]在假定哈丁·溫伯格平衡條件下，分別計算不同病菌群體多樣性參數：觀察等位基因數Na(observed number of alleles)、有效等位基因數Ne(effective number of alleles)、基因多樣性指數H(Nei’s gene diversity)、信息指數I(Shannon’s information index)、多態性位點數NP(the number of polymorphic loci)和多態位點百分率P(the percentage of polymorphic loci)。根據Nei’s遺傳距離，構建UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means)毒性聚類圖。整個數據分析過程，連鎖不平衡LD測驗(linkage disequilibrium)顯著性水平P值為0.05，中性檢驗采用1 000次隨機抽樣。

表1 四川盆地小麥白粉病菌毒力頻率Table 1 Virulence frequencies of Blumeria graminis f. sp. tritici in Sichuan Basin

2 結果與分析

2.1 四川盆地小麥白粉病菌毒性類型

189個菌株對26個抗病單基因鑒別品種(系)中的6～21個具有毒性，平均14.04個。其中，盆地西部病菌群體對6～21個單基因品種(系)具有毒性，平均為13.97個；盆地東部病菌群體對9～19個單基因品種(系)具有毒性，平均為14.93個(表2)。189個菌株總計檢測出183種毒性類型，其中盆地西部171種，盆地東部15種。僅出現1次的毒性類型有178種，占97.27%，盆地西部和盆地東部病菌群體各自占98.25%和80.00%。

盆地西部和東部病菌群體共有毒性類型有3組(表3)，分別是毒性類型V1a、2、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、5a、6、7、8、13、17、19、30，盆地西部檢測出2次(鹽亭，2014年；鹽亭，2015年)，東部1次(巴中，2015年)；毒性類型V1a、2、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、5a、6、7、8、17、19、30，盆地西部1次(安縣，2015)，東部1次(巴中，2015年)；毒性類型V1a、2、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、5a、5b、6、7、8、19、30、Era、XBD，盆地西部1次(郫縣，2014年)，東部1次(蒼溪，2014年)。此外，盆地西部檢測到另外2組共有毒性類型，各出現2次，分別是毒性類型V1a、2、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、5a、5b、6、7、8、19、30、Era(鹽亭，2014；郫縣，2015年)和V1a、3a、3b、3c、3e、3f、4a、5a、6、7、8、17、19、30(鹽亭，2014；郫縣，2016年)。

表2 四川省盆地小麥白粉病菌毒性類型Table 2 Virulence types of Blumeria graminis f. sp. tritici

表3 四川盆地小麥白粉病菌毒性類型及其分布Table 3 Virulence types and distribution of Blumeria graminis f. sp. tritici in Sichuan Basin

毒性類型：僅列出含有≥2個以上菌株的類型，括號內容為采集地點及年份。

Virulence types:Containing more than one isolate,and the origin is presented in the brackets.

2.2 四川盆地小麥白粉病菌毒力頻率

189份小麥白粉病菌株在26個單基因鑒別品種(系)上的毒力測定結果顯示，供試菌株群體對抗病基因Pm1a、Pm2、Pm3b、Pm3c、Pm3e、Pm3f、Pm4a、Pm4b、Pm5a、Pm6、Pm7、Pm8、Pm19、Pm30的毒力頻率高于60%，對Pm1c、Pm12、Pm16、Pm21和Pm24的毒力頻率低于20%(表1)。其中，對Pm21的毒力頻率為0，即未檢測到對其表現出有毒性的菌株。

個別基因在東西部間的分布差異較大(表1)。其中，供試菌株群體對Pm3d的毒力頻率，在盆地西部和盆地東部分別為47.13%和93.33%；對Pm13的毒力頻率，分別為17.24%和40%，盆地西部<盆地東部；而對Pm1c、Pm12、Pm16和Pm24的毒力頻率則相反，盆地西部>盆地東部。

2.3 四川盆地小麥白粉病菌毒性多樣性

小麥白粉病菌群體毒性多樣性結果顯示，189份樣品的觀察等位基因數、有效等位基因數、基因多樣性指數、信息指數、多態性位點數和多態位點百分率分別是1.961 5、1.506 3、0.301 4、0.460 1、25和96.15%，說明四川盆地小麥白粉病菌其毒性多樣性比較豐富(表4)。

地區間病菌群體存在一定的差異，盆地西部和盆地東部白粉菌群體的基因多樣性指數分別為0.300 5和0.273 5，信息指數分別為0.459 2和0.408 2，多態位點百分率分別為96.15%和76.92%。盆地西部病菌群體毒性多態性整體上高于盆地東部。

189個菌株毒性聚類結果發現，當Nei’s遺傳距離為25.0時，供試菌株被分為三大類群，來自盆地東部的2個菌株聚為第一個大類群，來自盆地西部的5個菌株聚為第二個大類群，此兩類群均為低毒菌株，其毒性譜變化范圍為6～11，其余182個菌株聚為第三個大類群。在Nei’s遺傳距離取值24時，第三個大類群可分為兩個亞類群。第一個亞類群包含13個菌株，低毒，其毒性譜范圍為6～13，其中1個來自于盆地東部，12個來自于盆地西部。剩余169菌株為第二個亞類群，包含盆地西部菌株157個和盆地東部菌株12個(圖1)。

表4 四川盆地小麥白粉病菌群體毒性多樣性指數Table 4 Virulence diversity parameters of Blumeria graminis f. sp. tritici in Sichuan basin

Na:觀察等位基因數；Ne:有效等位基因數；H:基因多樣性指數；I:信息指數；NP:多態性位點數；P:多態位點百分率。

Na:Observed number of alleles;Ne:Effective number of alleles;H:Nei’s gene diversity;I:Shannon’s information index;NP:The number of polymorphic loci;P:The percentage of polymorphic loci.

▲:盆地東部菌株，其他為盆地西部菌株

▲:East Sichuan Basin isolates,the others were derived from West Sichuan Basin

圖1四川189株小麥白粉病菌毒性聚類圖

Fig.1Virulencedendrogramof189wheatpowderymildewisolatesinSichuan

3 討 論

小麥白粉病是大區流行病害，四川盆地及其西部山區是小麥白粉病的常發區和重發區[11]，分析該地區小麥白粉病菌群體的毒性結構及其動態變化，了解四川省小麥白粉病抗性基因的抗性現狀，對于整個西南地區乃至東部地區小麥白粉病的流行預測和防治都有至關重要的作用。本研究結果表明，小麥抗白粉病基因Pm1a、Pm2、Pm3b、Pm3c、Pm3e、Pm3f、Pm4a、Pm4b、Pm5a、Pm6、Pm7、Pm8、Pm19、Pm30抗性較差，其毒性頻率已超過60%，不適合在四川省抗病育種和生產上繼續使用。而攜帶有Pm1c、Pm12、Pm16、Pm21和Pm24的品種和抗源均可在育種或生產上應用，其毒性頻率變化范圍為0～20%，這與小麥白粉病全國大區流行趨勢基本一致[12-14]。作為我國目前抗白粉病譜最廣的基因，Pm21已被成功轉入到許多小麥品種中，且在多個省份或區域中表現為免疫[15-17]。近十年對Pm21表現毒性菌株的報道時有發生[11,18-20]。本研究未監測到對Pm21表現出有毒性的菌株，后期應繼續關注。

除了受大區流行趨勢的影響，小麥白粉病菌還呈現區域流行特點。本研究中，Pm3d、Pm13、Pm1c、Pm12、Pm16和Pm24，在盆地西部和盆地東部的毒力頻率差異較大，其原因可能與各地區小麥品種的選擇壓力有關。特有毒性類型的大量存在，表明各地區的病菌都在以適應當地的方式進行獨立的進化，而盆地西部病菌群體毒性類型更多，毒性譜變化范圍更廣，毒性多樣性指數更高，除了與各地區小麥品種的選擇壓力有關外，還可能與盆地西部、川西北、隴南越夏菌源交流有關，值得進一步的研究。