D-來蘇糖異構酶的酶學性質研究

黃嘉葦 ，施 悅 ，張文立 *， 張 濤 ， 江 波 ，沐萬孟

（1．食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2.江南大學 協同創新中心，江蘇 無錫214122）

近年來，D-甘露糖的制備成為研究熱點。目前，主要通過提取、化學合成和生物手段制備D-甘露糖，提取是目前應用較多的方法，但該方法易受到原料的季節影響[1-16]?；瘜W法可將D-葡萄糖直接轉化為D-甘露糖，但這一過程需要化學催化劑，并必須嚴格控制溫度和酸濃度[17]。利用生物法進行單糖之間的轉化生產D-甘露糖具有催化效率高、反應條件溫和且成本低等優點。目前，甘露糖的生物法制備主要以D-葡萄糖或D-果糖為原料，利用單糖異構或差向異構來實現。D-來蘇糖異構酶 （D-LI，EC 5.3.1.15）、D-甘露糖異構酶（EC 5.3.1.7）和纖維二糖差向異構酶（EC 5.1.3.11）都已被報道具備D-甘露糖生產能力。但是，目前鑒定的D-甘露糖異構酶大多催化效率不高，反應溫度也較低。纖維二糖差向異構酶是目前已報道唯一可以催化葡萄糖差向異構化生成甘露糖的酶，但該酶的轉化率較低，同時會生成大量D-果糖為副產物[18]。

D-來蘇糖異構酶是一種醛酮糖異構酶，可以有效催化D-木酮糖和D-來蘇糖以及D-果糖和D-甘露糖之間的差向異構反應[19]。因其較寬的底物特異性，利用D-LI生產D-甘露糖也受到了研究者的關注。目前，已有9種來自不同微生物的D-LI被報道。1956年，Anderson and Allison首次報道了來自Aerobacter aerogenesPRL-R3 的 D-LI[20]，該酶具有催化D-來蘇糖和D-甘露糖的能力。在這之后，其他來源的D-LI陸續被鑒定，分別來源于Cohnella laevoribosiiRI-39[21]、Providencia stuartiiKCTC 2568[22]、Serratia proteamaculansKCTC 2936[23]、Escherichia coliO157：H7[24]、Bacillus subtilis168[25]、Bacillus licheniformisDSM13[26]、Dictyoglomus turgidumDSM 6724[27]和Thermosediminibacter oceaniDSM 16646[28]。目前，大部分研究主要集中于挖掘D-LI的新的微生物來源及改進其對D-來蘇糖的催化效率，而利用D-LI生物生產D-甘露糖的研究相對較少，僅有來自于P.stuartiiKCTC 2568[22]，S.proteamaculansKCTC 2936[23]和T.oceaniDSM 16646[28]的 D-LI 被研究用于催化D-果糖生物轉化D-甘露糖。

Peptococcaceae bacterium1109是從牛糞中發現的一種嗜熱細菌，Town JR等已經將P.bacterium1109的全基因組序列解析公布在GenBank上，登錄號為LDJB01000001.1。該微生物的全基因組中存在可能編碼D-LI的推定基因，登陸號為：KLU40859.1，含有180個氨基酸[29]。作者克隆了來源于P.bacterium1109的D-LI推定基因，將其導入到大腸桿菌表達系統中進行表達，對重組酶進行分離純化操作，研究了其酶學性質以及從D-果糖生物轉化D-甘露糖，為酶法工業化生產D-甘露糖奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒和菌株

E.coliBL21（DE3）、E.coliDH5α：作者所在實驗室保藏。

1.2 培養基

LB液體培養基（g/L）：酵母提取物 5，氯化鈉10，胰蛋白胨10，氨芐霉素的終質量濃度為50 μg/mL。

LB固體培養基（g/L）：酵母提取物 5，氯化鈉10，胰蛋白胨10，瓊脂添加量為質量分數1.8%，氨芐霉素的終質量濃度為100 μg/mL。

1.3 主要試劑與材料

酵母提取物、胰蛋白胨、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和標準蛋白marker，牛血清蛋白標準品（BSA）：購自上海生工生物工程有限公司；D-果糖、D-甘露糖、D-來蘇糖、D-木酮糖、L-核糖、L-核酮糖：購自 Sigma-Aldrich公司；其他化學試劑為分析純。

1.4 儀器與設備

蛋白電泳系統、凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司產品；高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司產品；高效液相色譜（HPLC）系統：美國Waters公司產品；Carbomix Ca-NP10色譜柱：美國賽分科技公司產品；TSKgel G3000 SWXL凝膠色譜柱：默隆 （上海）實業有限公司產品。

1.5 實驗方法

1.5.1 重組D-LI的基因克隆及誘導表達P.bacterium1109是一種耐熱型微生物，克隆其D-LI基因（GenBank登錄號為LDJB01000001.1，編碼氨基酸序列登錄號為ADL08607.1）。在5’端和3’端分別引入酶切位點NdeI和XhoI，至載體pET-22b（+）上，獲得重組質粒pET-Peba-D-LI轉化至大腸桿菌E.coliBL21（DE3）中表達。在基因序列的C’末端融合6個組氨酸標簽，以便于重組蛋白純化。

1.5.2 重組D-LI的純化分離 挑取構建成功的重組菌的單菌落接種到4 mL含Amp的LB液體培養基中，于37℃搖床250 r/min過夜培養，將種子培養液以體積分數2%接種量接種至200 mL LB液體培養基中，37℃、200 r/min條件下培養至OD600值達到0.6～0.8，添加IPTG誘導劑至終濃度1 mmol/L，28℃、200 r/min低溫誘導培養6 h。收集誘導表達完成的菌體，用裂解液洗滌重懸超聲破碎后的菌體，將重懸液在4℃、8 000 r/min的條件下離心15 min，0.45 μm濾膜過濾上清液，使用螯合Ni2+的填充層析柱進行酶純化操作。

在低溫條件下，用5個柱體積的去離子水沖洗Ni2+填充層析柱；再用 3～4個柱體積的Binding Buffer（500 mmol/L NaCl，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）平衡Ni2+層析柱；隨即將粗酶液加入層析柱中，粗酶液緩緩流經Ni2+層析柱，使目的蛋白與Ni2+層析柱充分結合；然后用5個柱體積的Wash Buffer（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）洗脫雜蛋白；最后用5個柱體積的 Elution Buffer （500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）洗脫目的蛋白。使用含EDTA的磷酸鹽緩沖溶液 （10 mmol/L EDTA，50 mmol/L，pH 7.5）透析 6 h，螯合去除酶液中的金屬離子；之后用不含EDTA的磷酸鹽緩沖溶液（50 mmol/L，pH 7.5）透析兩次，每次 6 h，除去殘存的EDTA，得到純酶液。

1.5.3 重組D-LI的相對分子質量測定 利用丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測重組蛋白質單亞基相對分子質量，電泳的分離膠和濃縮膠丙烯酰胺質量濃度分別為12 g/dL和5 g/dL，考馬斯亮藍R250作為蛋白顯色劑。

利用配備了紫外檢測器和TSKgel G2000SWxl凝膠色譜柱的高效液相系統檢測重組酶的全相對分子質量。HPLC條件為：流動相：100 mmol/L KH2PO4，100 mmol/L Na2HPO4， 質 量 分 數 0.05%NaN3，100 mmol/L Na2SO4，pH 6.8； 流量：1 mL/min。柱溫：23℃；檢測器條件：UV 280 nm。

1.5.4 重組D-LI的酶活測定 D-甘露糖轉化的酶反應體系為 1 mL，D-果糖 10 mmol/L，CoCl21 mmol/L，磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）50 mmol/L，重組酶0.1 U/mL。在70℃條件下反應10 min，煮沸10 min終止酶反應。

D-甘露糖檢測：將反應結束后的產物離心（4 ℃，12 000 r/min，30 min）， 使用 0.22 μm 微濾膜過濾上清液，稀釋后使用HPLC進行檢測。檢測條件：Waters 2695型高效液相色譜儀，Waters示差折光檢測器（RI），Carbomix Ca-NP10 色譜柱（10 μm，D7.8 mm×300 mm），0.22 μm 濾膜過濾后的超純水作為流動相，柱溫85℃，流量0.6 mL/min。

酶活單位U定義：pH 7.5、70℃的條件下，單位時間內酶催化D-果糖產生1 μmol的D-甘露糖所需要的加酶量定義為一個酶活單位。

1.5.5 重組D-LI的最適溫度和熱穩定性測定 將1 mL的酶反應體系分別置于不同溫度 （45～85℃）條件下參照1.5.4方法測定各反應溫度下的相對酶活，確定最適反應溫度，將酶活最高的一組設為相對酶活100%。

將純化后的酶液分別在70～80℃的條件下保溫，每隔30 min間隔取樣，并立即在標準條件下測定活性。定義初始酶活為相對酶活100%。

為研究重組酶的結構穩定性，使用TA Nano-DSC測定該重組酶Tm值。以酶的透析液作為空白基線，將DSC儀器平衡300 s。從30℃加熱至110℃，升溫速率為1℃/min。使用Nano Analyze軟件對DSC數據進行校正分析，并計算重組酶的Tm值。

1.5.6 重組D-LI的最適pH 將1 mL的酶反應體系分別置于不同pH（pH 4.5～9.0）條件下測定各反應pH下的相對酶活，確定最適反應pH，并將酶活最高的一組設為相對酶活100%。實驗中用到3種不同的緩沖體系：醋酸鹽緩沖液（pH 4.5～6.0）；磷酸鹽緩沖液（pH 6.0～7.5）；Tris-HCl緩沖液（pH 7.5～9.0）。

1.5.7 金屬離子對重組D-LI酶活的影響 在1 mL的酶反應體系添加1 mmol/L不同種類的二價金屬離子 （Co2+、Mn2+、Ni2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+），測定不同種類的金屬離子對酶催化反應的影響，確定酶反應的最適離子，并將酶活最高的一組設為相對酶活100%。

1.5.8 重組D-LI動力學參數的測定 研究重組酶的底物特異性和反應動力學，分別以5～200 mmol/L的D-果糖、D-甘露糖、D-來蘇糖、L-核糖作為底物，在最適條件下進行酶反應，測定酶活。通過Lineweaver-Burk雙倒數法作圖，并計算出重組酶的動力學參數：米氏常數Km值、催化常數kcat值和催化效率kcat/Km值。

1.5.9 重組D-LI平衡轉化率的測定 為測定D-果糖和D-甘露糖的反應平衡轉化率，以10 mmol/L的D-果糖為底物，加入1 mmol/L Co2+和0.3 U/mL重組酶，在45～85℃的條件下，反應48 h，測定D-甘露糖轉化率。

1.5.10 D-甘露糖的大規模生物轉化 為研究D-果糖和D-甘露糖之間的大規模生物轉化，分別以100、300、500 g/L的高質量濃度D-果糖溶液為底物進行長時間生物轉化。加入1 mmol/L Co2+和0.3 U/mL重組酶，在70℃，pH 7.5條件下反應，測定重組酶的催化反應進程。間隔時間取樣滅活，檢測其中D-甘露糖生成量。

2 結果與討論

2.1 重組D-LI的質粒構建與表達

2.1.1 重組D-LI的重組質粒構建P.bacterium1109微生物的全基因組序列已在NCBI中公布，登錄號為：LDJB01000001.1，經預測該微生物存在基因片段能夠編碼D-LI，基因片段KLU40859全長543 bp，可編碼180個氨基酸，理論相對分子質量為20.35×103。在該基因片段上下游引物5’端分別引入NdeI和XhoI酶切位點，由上海捷瑞生物工程有限公司合成后連接到pET-22b（+）表達載體（圖1），獲得重組質粒pET22b-peba-D-LI。為了簡化重組蛋白的純化步驟，在重組質粒C-端添加了6×his-tag標簽。

圖1 重組D-LI質粒構建Fig.1 Constructed recombinant plasmid of D-LI

2.1.2 重組D-LI的氨基酸序列分析 通過Espript軟件（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/），將來源于P.bacterium1109的D-LI的氨基酸序列與已經報道的其他8種D-LI的氨基酸序列進行序列比對（圖2）。高亮紅色表示氨基酸殘基100%相同；藍色方框中字體紅色表示75%以上的氨基酸殘基相同；空白表示氨基酸殘基完全不同。結合已報道的來源于B.sutbilis的D-LI晶體結構可以看出，所有已鑒定的D-LI在關鍵位點上的氨基酸殘基上具有嚴格的保守或較高的相似度。例如，二價金屬離子調節位點上 （103、105、171位的 3個 His和 110位的Glu）；與D-果糖和離子結合相關的6個氨基酸殘基（K90，K108，E110，E186，D193，N917 和 R205）， 除了與D-果糖的O-2結合相關的N917，其余氨基酸殘基均為嚴格保守，同時，在917位點上，除了S.proteamaculansKCTC 2936[23]，E.coliO157：H7[24]，B.licheniformisDSM13[26]，其余報道的D-LI的該位點上氨基酸都是Ile。而通過氫鍵與D-果糖的O-4結合的203與208位點處的氨基酸殘基并不保守，可能是造成不同的酶對底物特異性識別和親和力大小不同的原因。

2.1.3 重組D-LI在E.coliBL21（DE3）中的表達將來源于P.bacterium1109的D-LI按照1.5.2方法進行誘導表達，重組質粒C-端末尾引入的6×histag標簽可以高度親和 Ni2+，使用 Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow親和色譜快速純化目的蛋白。將誘導純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE蛋白電泳檢測（圖3）。分析結果顯示，全細胞及純酶樣品在21×103處出現明顯的目的條帶，與重組蛋白的理論相對分子質量20.78×103結果相一致。隨著誘導時間的延長，該處的條帶逐漸加寬，純化后的酶液電泳條帶單一，純度達到電泳純。證明該D-LI目的基因的大腸桿菌基因工程菌成功構建，并且誘導表達。

2.1.4 重組D-LI的全相對分子質量測定 使用TSKgel G2000SWxl凝膠色譜柱，利用紫外檢測器測定來自P.bacterium1109的D-LI的蛋白全相對分子質量。繪制蛋白全相對分子質量標準曲線（圖4），參照標準曲線得出該重組酶的相對分子質量大約為42×103，SDS-PAGE結果顯示該酶的單亞基相對分子質量為21×103，因此，該酶為二聚體結構。目前已經被鑒定的來源于C.laevoribosiiRI-39[21]、P.stuartiiKCTC 2568[22]、S.proteamaculansKCTC 2936[23]、E.coliO157：H7[24]、D.turgidumDSM 6724[27]以及T.oceaniDSM 16646[28]的D-LI均為二聚體結構，其中， 來源于P.stuartiiKCTC 2568[22]，D.turgidumDSM 6724[27]及T.oceaniDSM 16646[28]的酶 相 對 分 子質量與本實驗的重組酶相近，為44×103。

圖2 D-LI的氨基酸序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of amino acids from D-LI

圖3 純化后的重組蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein

2.2 重組D-LI的酶學性質鑒定

2.2.1 重組D-LI的最適溫度及溫度穩定性 溫度是影響酶催化效率的重要條件之一。較高的溫度有利于增強化學反應速率，但溫度升高的同時，也會加速酶蛋白的變性，降低酶的催化效率[30-31]。通過測定45～85℃的酶活力，得到該酶隨著溫度變化的酶活力曲線（圖5）。可以看出，在45～70℃，該酶的活力隨著溫度的升高而增加。溫度達到70℃時，酶的活力最高。并且在60～70℃時，重組酶有較高的催化效率。當溫度超過70℃時，重組酶的活力急劇下降，80℃時酶活僅為保留最高酶活的20%。

圖4 D-LI全相對分子質量測定Fig.4 Determination of total molecular weight of D-LI

將純酶溶液在70、75、80℃條件下保溫，定時取樣觀察酶的活力損失情況。定義初始酶活為100%，采用一級動力學模型，將不同時間酶的相對酶活作圖（圖6）?？梢钥闯觯撁冈?0℃和75℃條件下比較穩定，70℃條件下保溫2 h，仍能保持84%的酶活，75℃保溫1.5 h，酶活為81%。當在80℃保溫時，酶活損失較快，保溫1.5 h后，酶活下降至約50%。在 70、75、80°℃下，酶的衰減常數分別為0.1040、0.1258、0.4309， 相應的半衰期分別為 6.66、5.51、1.61 h。通過TA Nano-DSC測得該重組酶的Tm值為67.20℃（圖7），說明該重組酶蛋白的熱穩定性較高。

圖5 溫度對重組D-LI催化活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the enzyme activity of the recombinant D-LI

圖6 重組D-LI的熱穩定性Fig.6 Effect of temperature on the thermostability of the recombinant D-LI

圖7 重組D-LI的DSC分析Fig.7 DSC analysis of the recombinant D-LI

目前已報道的D-LI的最適溫度大多在40至75℃之間，來源于D.turgidumDSM 6724[27]的D-LI最適溫度為75℃，是目前最適反應溫度最高的DLI。盡管來源于P.bacterium1109的最適溫度略低于D.turgidumDSM 6724，但是相對而言有較好的熱穩定性，在70、75、80℃的條件下半衰期為6.66、5.51和1.61 h，而來源于D.turgidumDSM 6724的D-LI在這幾個溫度條件下半衰期分別為2.8、1.8和0.8 h。 此外， 除了C.laevoribosiiRI-39[21]，D.turgidumDSM 6724[27]以及T.oceaniDSM 16646[28]是來源于耐熱微生物，其他報道的D-LI都來源于嗜溫微生物。在醛酮糖異構酶的工業化應用中，來源于耐熱微生物的酶往往具有更高的熱穩定性，也更適合應用于工業生產。綜合比較已報道的D-LI，本研究鑒定的D-LI具有較高的最適反應溫度和較強的熱穩定性，具有一定工業應用價值。

2.2.2 重組D-LI的最適pH 酶的活性易受到體系pH的影響。酶在不同的pH條件下活性會有所不同，不同的酶的有各自的最適pH。通過測定pH 4.5至9.0的pH值緩沖環境下重組D-LI酶活的變化（圖8），發現該酶的最適pH條件為pH 7.5的磷酸鹽緩沖體系。pH在4.5至5.5之間時，相對酶活較低，隨著酸性的增強，酶活急劇下降，可見該酶在酸性條件下時較為敏感。pH大于7.5時，酶活相對穩定，隨著堿性增強，酶活損失較慢，說明該重組酶在中性及弱堿性環境下較為穩定。

綜合比較目前已報道的D-LI可以發現，大部分酶的最適pH為中性偏堿性，而來源于C.laevoribosiiRI-39[21]和T.oceaniDSM 16646[28]最 適pH為6.5。在糖酶的催化反應中，弱酸性環境有利于抑制碳水化合物的美拉德反應，減少非酶褐變和副產物的產生，有利于工業化生產[32-33]。

圖8 pH對重組D-LI催化活性的影響Fig.8 Effect of pH on the enzyme activity of the recombinant D-LI

2.2.3 重組D-LI的最適金屬離子 金屬離子可以作為輔助因子或激活劑，在酶反應中起著十分重要的作用。在單糖異構酶中，金屬離子往往對酶活有十分重要的影響。作者研究了不同二價金屬離子對重組D-LI酶活的影響（表1）。以純化后經EDTA處理的原始酶作為對照組，可以看出，金屬離子對酶反應有比較大的影響。其中，Co2+可以將酶活提高為對照組的 170 倍以上。 Mn2+、Ca2+、Ba2+以及 Mg2+也對酶反應有一定促進作用。添加Mn2+時的酶活達到未添加時的143%，添加Ca2+時的酶活達到未添加時的127%，添加Ba2+時的酶活達到未添加時的147%，添加Mg2+時的酶活達到未添加時的123%。另外幾種離子 Ni2+、Fe2+和 Zn2+的添加會抑制酶活，添加 Cu2+后幾乎沒有酶活。

表1 金屬離子對D-LI活性的影響Table 1 Effect of metal ions on the enzyme activity of D-LI

目前鑒定的D-LI中，除了來源于D.turgidumDSM 6724[27]的D-LI最適金屬離子也是Co2+，其他所有被報道的D-LI的最適金屬離子都是Mn2+。大部分D-LI可以被Mn2+或Co2+激活，但是來源于C.laevoribosiiRI-39[21]和P.stuartiiKCTC 2568[22]的 DLI活性卻會被Co2+抑制。離子在許多單糖異構酶的催化作用中起著十分重要的作用，如L-阿拉伯糖異構酶[34]，酮糖 3-差向異構酶[35]，L-鼠李糖異構酶[36]和D-葡萄糖異構酶[37]。此外，金屬離子與一些糖酶的穩定性有關。例如，添加金屬離子可以改善D-阿洛酮糖3-差向異構體和L-鼠李糖異構酶的熱穩定性和結構穩定性[38-39]。

2.2.4 重組D-LI的動力學參數研究 分別以5-200 mmol/L D-來蘇糖、D-甘露糖、D-果糖、D-核糖為底物，研究重組D-LI的底物特異性（表2）。在最適條件下進行酶反應，反應后通過HPLC測定酶活性。通過Lineweaver-Burk雙倒數法作圖，計算重組D-LI的米氏常數Km值、催化常數kcat值和催化效率kcat/Km值。通過Km值，可以直觀看出酶與底物親和力的大小，Km值越大代表酶與底物的親和力越校；kcat代表酶的催化速率，kcat值越大，代表酶催化速率越高；kcat/Km則代表酶反應的催化效率，kcat/Km值越大，則酶的催化效率越高[40]。結果顯示，該重組酶的最適底物是D-來蘇糖，比酶活可以達到為（7.755±0.3）U/mg。以 D-甘露糖為底物時，比酶活為 （5.424±0.1）U/mg，D-果糖為底物時， 比酶活為（2.544±0.2）U/mg，以L-核糖為底物時，比酶活為（1.848±0.1） U/mg。

表2 來源于P.bacterium 1109的D-LI比酶活與動力學參數Table 2 Specific activities and kinetic parameters of D-LIfrom P.bacterium 1109

以D-來蘇糖為底物時，Km值和kcat/Km值分別為 12.868 mmol/L、58.032 L/（mmol min）；以 D-甘露糖為底物時，Km值和kcat/Km值分別為33.467 mmol/L、10.138 L/（mmol·min）。以 D-果糖為底物時，Km值和kcat/Km值分別為 21.092 mmol/L、7.353 L/（mmol·min）；以L-核糖為底物時，Km值和kcat/Km值分別為1 130.088 mmol/L、3.628 L/（mmol·min）。 可以看出，該重組酶對D-來蘇糖、D-甘露糖、D-果糖和L-核糖都有催化活性，且相對活性依次降低；該重組酶對D-來蘇糖的Km值最小，說明與D-來蘇糖的親和力最強；同時kcat/Km值較大，說明D-來蘇糖有較高的催化效率，最適底物為來蘇糖，為D-LI。對比其他幾種已報道的D-LI的動力學參數可以看出，來自P.bacterium1109的D-LI是目前已報道的對D-果糖親和力最強，催化效率最高的酶，這進一步說明了該酶在D-果糖生物生產D-甘露糖的工業應用中具有較高的價值。

2.2.5 重組D-LI的平衡轉化率 為測定D-果糖和D-甘露糖的反應平衡轉化率，以10 mmol/L D-果糖為底物，在最適條件下，50～80℃酶反應48 h，測定D-甘露糖轉化率（表3）。在40～70℃時，該反應的平衡轉化率受溫度影響不大，在24.2%至25.2%之間，并且隨著溫度的升高，甘露糖的轉化率逐漸變小，平衡朝向果糖轉移。而反應溫度高于70℃時，甘露糖的轉化率很快降到10%左右，這可能是由于該酶在70℃以上時迅速失活，同時反應平衡也隨著溫度的升高進一步向果糖移動。目前已報道的D-LI大部分平衡轉化率在20%左右，除了來源于B.licheniformisDSM13[26]的轉化率較高，為30%，來源于P.stuartiiKCTC 2568[22]的轉化率與該酶相近，都是25%。

表3 不同溫度下D-甘露糖的平衡轉化率Table 3 Transformation ratio of D-mannose at different temperatures

2.2.6 D-甘露糖的大規模生物轉化 為研究D-果糖和D-甘露糖的底物轉化情況，分別以100、300、500 g/L的D-果糖為底物，在最適條件下，進行長時間生物轉化，每隔一定時間取樣滅活，稀釋后檢測D-甘露糖生成量（圖9）。以100 g/L的D-果糖為底物時，反應3 h平衡時D-甘露糖的轉化率為23.81%，D-甘露糖質量濃度為23.81 g/L。以300 g/L的D-果糖為底物時，反應5 h達到平衡狀態，D-甘露糖反應平衡時生成率為22.35%，D-甘露糖質量濃度為67.05 g/L。以500 g/L的果糖為底物時，反應8 h后達到平衡狀態，平衡時甘露糖的產率為19.17%，甘露糖質量濃度為96.85 g/L。底物質量濃度的增加可以促進反應平衡向右移動，得到更多的產物，但當反應達到平衡之后，產物的抑制作用會使轉化率輕微降低。

圖9 D-甘露糖的生物轉化Fig.9 D-Mannose production from D-fructose by D-LI

3 結語

作者鑒定了一株來源于耐熱微生物P.bacterium1109的D-LI，并將其應用于D-甘露糖的生物法合成。通過合成該D-LI的編碼基因，將其連接到質粒pET-22b（+）載體上，并轉化至表達宿主大腸桿菌E.coliBL21（DE3）中，實現了該酶在大腸桿菌中的外源表達。對目的蛋白進行分離純化后研究了該酶的酶學性質，以D-果糖為底物時，重組表達的D-LI的比酶活可達1.2 U/mg。該重組D-LI的最適pH為7.5，最適溫度為70℃。該重組酶在中性及弱堿性環境下和70～75℃的溫度下有較好的熱穩定性，70和 75℃的半衰期分別為 6.66、5.51 h。Co2+可以顯著提高該酶的活力。研究其底物特異性發現，該D-LI的最適底物為D-來蘇糖，但是對D-果糖也有較高的親和力和相對較高的催化效率。在最適條件下以500 g/L的果糖為底物，反應8 h達到平衡，平衡轉化率達19.17%。