新型啤酒穩定劑對啤酒蛋白質吸附特性的研究

唐棟健，鄭飛云，馬軍濤，成 貴，朱林江，李永仙*，李 崎

（1.江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.溧陽市鴻智新材料科技有限公司，江蘇 常州213000）

引起啤酒非生物渾濁的因素主要有蛋白質—多酚渾濁、葡聚糖糊精渾濁、酒花樹脂渾濁以及草酸鈣結晶沉淀等，其中大部分混濁來自于蛋白質—多酚混濁[1]。通過氨基酸分析發現，啤酒混濁蛋白脯氨酸含量較高，且蛋白質所含脯氨酸摩爾含量越高越容易形成混濁物質[2]。啤酒生產過程除了嚴格控制生產工藝和原料外，還經常添加非生物穩定劑來控制啤酒混濁。目前市場上廣泛使用的穩定劑有PVPP、硅膠、單寧酸等，這些穩定劑可除去啤酒中的混濁活性蛋白質或混濁活性多酚[3]。作者所用新型啤酒穩定劑（BFSA）系基于特殊處理的硅藻土，但其吸附特性和作用機理尚不完全明確。

通過對BFSA吸附的啤酒蛋白質進行氨基酸分析以及對BFSA吸附蛋白質過程進行吸附等溫線、吸附動力學和吸附熱力學分析，初步探究了BFSA吸附啤酒蛋白質機理。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海博訊醫療設備廠產品；凱氏定氮儀：瑞士FOSS公司產品；真空抽濾機：VACUUBRAND公司產品；NEXUS傅里葉變換紅外光譜儀：美國尼高力儀器公司產品；安捷倫液相色譜儀：美國安捷倫公司產品。

作者使用的新型啤酒穩定劑BFSA化學成分（質量分數）：SiO2（90.42%）、Al2O3（1.95%）、Fe2O3（1.33%）、其他（6.3%）。

1.2 研究方法

1.2.1 紅外光譜分析 取少量BFSA與KBr混合研磨粉碎，壓片后樣品放入傅里葉變換紅外光譜儀進行FT-IR分析。

1.2.2 振蕩吸附實驗 100 mL已知蛋白質質量濃度的除氣啤酒中加入0.05 g BFSA，置于振蕩水浴鍋中， 振蕩速度 150 r/min，5、15、25、35 ℃下振蕩15、30、45、60、75、90 min 后取樣， 真空抽濾機抽濾后消化并使用凱氏定氮儀測定其吸附容量。

1.2.3 啤酒蛋白質濃度測試方法

取5 mL除氣啤酒，放入消化管加4～5滴濃硫酸220℃消化100 min，然后加5 g定氮催化劑和12 mL濃硫酸420℃消化100 min并使用凱氏定氮儀測定啤酒蛋白質質量濃度。

1.2.4 BFSA吸附蛋白質氨基酸分析 600 mL已知蛋白質質量濃度的除氣啤酒中加入0.3 g BFSA，20℃振蕩吸附1 h，干燥后稱取一定質量的BFSA，HCl水解后用氨基酸分析儀測定BFSA吸附蛋白質的氨基酸組成。

1.2.5 吸附等溫線、動力學、熱力學的數據收集實驗方法 采用1.2.2振蕩吸附實驗，測定啤酒初始蛋白濃度對BFSA吸附的影響，此數據用于吸附等溫線分析；測定吸附時間和吸附溫度對BFSA吸附的影響，此數據用于吸附動力學分析和吸附熱力學分析。

2 結果與討論

2.1 BFSA紅外光譜分析

圖1為BFSA的紅外光譜圖，在3 428 cm-1附近存在OH伸縮振動，1 093 cm-1附近存在Si-O反對稱伸縮振動，793 cm-1附近存在Si-O對稱伸縮振動，467 cm-1附近存在Si-O-Si反對稱彎曲振動[4]，以上數據尤其是OH伸縮振動明確了BFSA中羥基的存在，對氫鍵作用的可能性提供了基礎。

2.2 BFSA吸附啤酒蛋白質的氨基酸分析

由于啤酒混濁蛋白質富含脯氨酸[2]，因此可通過對BFSA所吸附的蛋白質進行氨基酸分析來評價其對混濁敏感蛋白質的吸附專一性。脯氨酸含量的越高，說明BFSA對混濁敏感蛋白質的吸附專一性就越高。如圖2所示，啤酒中蛋白質脯氨酸質量分數為7.53%，而BFSA吸附蛋白質的脯氨酸質量分數增加至9.71%，表明BFSA對啤酒混濁敏感蛋白有較好的吸附選擇性。

圖1 BFSA紅外光譜圖Fig.1 FT-IR of BFSA

圖2 BFSA吸附啤酒蛋白質的氨基酸分析Fig.2 Amino acid of beer protein adsorbed with BFSA

2.3 BFSA吸附影響因素分析

2.3.1 吸附時間和溫度對BFSA吸附的影響 在啤酒蛋白質質量濃度為2 980 mg/L，吸附劑用量0.5 g/L，體系pH為4.3的條件下，考察吸附時間和溫度對BFSA吸附啤酒蛋白質的影響。結果如圖3所示，當吸附時間小于1 h時，BFSA的吸附容量隨著時間的增加而增加，當吸附時間大于1 h時，BFSA的吸附容量幾乎無變化，該吸附過程在1 h作用達到平衡。

2.3.2 啤酒蛋白質質量濃度對BFSA吸附的影響吸附劑用量為0.5 g/L，體系pH為4.3，吸附時間為1 h，吸附溫度為20℃條件下，分別將蛋白質質量濃度為 5 525 mg/L 的啤酒稀釋 20、10、5、2.5、1.25 倍，得到蛋白質質量濃度為 276.25、552.5、1 105、2 210、4 420、5 525 mg/L，并加入少量酸調節使溶液pH不變，考察初始啤酒蛋白質質量濃度對BFSA吸附容量的影響。結果如圖4所示，BFSA吸附容量隨著質量濃度的增加而升高，在啤酒蛋白質初始質量濃度較小的情況下，BFSA吸附容量迅速增加，當蛋白質質量濃度上升到一定濃度后，BFSA吸附容量增加緩慢。

圖3 吸附時間和吸附溫度對BFSA吸附的影響Fig.3 Effect of adsorption time and temperature on BFSA

圖4 啤酒蛋白質質量濃度對BFSA吸附的影響Fig.4 Effect of beer protein concentration on BFSA

2.4 BFSA吸附機理探究

2.4.1 吸附等溫線分析 圖5為BFSA對啤酒蛋白質的平衡吸附等溫線，采用式（1）和式（2）對2.3.2實驗數據進行擬合，擬合得到的等溫線參數經計算后列于表1中[5-6]：

式中，Qe為平衡吸附量 （mg/g）；Qm為飽和吸附量（mg/g）；Ce為吸附后啤酒蛋白質溶液的平衡質量濃度 （mg/L）；b為 Langmuir 吸附常數 （L/g）；KF為Freundlich 吸附常數（mg/g）·（L/mg）1/n；n為Freundlich吸附常數，無因次。

圖5 BFSA吸附啤酒蛋白質的吸附等溫線Fig.5 Adsorption isotherm of beer protein on BFSA

對比2種吸附等溫線方程的相關系數R2，Freundlich方程更符合BFSA對啤酒蛋白質吸附過程，說明吸附過程更接近于多分子層吸附理論。Freundlich吸附方程式中1/n＜1時吸附比較容易進行，1/n＞1 時則表明吸附困難[7]。

BFSA對啤酒蛋白質的吸附容量可由Langmuir等溫線模型中的單層飽和吸附量Qm值表示。由Langmuir參數可知，20℃時BFSA對啤酒蛋白質的平衡吸附量為71.40 mg/g。另一個重要參數-吸附平衡參數RL由式（3）計算得到：

式中：b為Langmuir常數；C0為啤酒初始蛋白質質量濃度（mg/g）；RL為無因次參數，RL=0表明吸附不可逆；0＜RL＜1表明吸附有利于向吸附方向進行，RL越小越有利于吸附的進行[8]；RL=1表明吸附處于一個線性平衡狀態；RL＞1表明吸附有利于向解析方向進行。

圖6表明，隨著啤酒蛋白質初始質量濃度的升高，RL在逐漸降低，說明啤酒蛋白質質量濃度越高越有利于吸附的進行。

2.4.2 吸附動力學分析 研究了不同溫度和時間對BFSA吸附的影響，吸附初始時BFSA對蛋白的吸附速率很快，隨著時間增加吸附速率開始減小，這可能是因為吸附初期BFSA表面的空余吸附位點較多且啤酒溶液的蛋白質質量濃度比BFSA表面大，因此吸附初期速率較快。隨著吸附的進行，BFSA表面活性位點逐漸減少，導致吸附速率開始降低[9-13]。 采用式（4）和式（5）擬合圖 7數據，擬合曲線如圖7所示，計算得到的準一級、二級動力學參數如表2所示：

圖6 RL與C0的關系曲線Fig.6 Curve of RLand C0

式中：Qt為t時刻吸附量 （mg/g）；Qe為平衡吸附量（mg/g）；K1為一級動力學速率常數 （min-1）；K2為二級動力學速率常數（g/（mg·min））。

圖7 不同溫度下BFSA對啤酒蛋白質的準一級、準二級動力學方程擬合Fig.7 Fitting the adsorption kinetics curve of beer protein on BFSA by two models in different temperatures

由表1中模型相關系數R2可以看出，準二級動力學方程R2值更高，因此實驗范圍內BFSA吸附啤酒蛋白質更加符合準二級動力學方程。

2.4.3 吸附熱力學分析 由于BFSA吸附過程更符合準二級動力學方程，所以根據式（6）Arrhenius公式所作的lnK2～1/T關系圖，以lnK2為縱坐標，1/T為橫坐標，直線回歸后所得到的斜率就是-E/R，如圖8所示，因此可以計算得到BFSA吸附啤酒蛋白質的活化能，計算結果見表3對吸附而言，物理吸附活化能較低E值在5～40 kJ/mol左右，化學吸附的活化能較高在40～800 kJ/mol左右。如表4所示，BFSA對啤酒蛋白質的吸附的E值為26.28 kJ/mol，說明吸附過程是物理吸附[15]。

式中：K為二級動力學速率常數；K0為指前因子；E為BFSA吸附啤酒蛋白質活化能（kJ/mol）；R為摩爾氣體常數（8.314J/（mol·K））；T為啤酒溶液溫度（K）。

表1 BFSA吸附啤酒蛋白質動力學參數Table 1 Adsorption kinetics parameters of beer protein on BFSA

圖8 BFSA對啤酒蛋白質吸附的lnK2～1/T關系圖Fig.8 lnK2～1/T plots for adsorption of beer protein on BFSA

通過計算吸附自由能（ΔG），焓變（ΔH）和熵變（ΔS）研究啤酒蛋白質在BFSA表面的吸附熱力學，3個熱力學參數之間的關系如式下：

式中：qT為在t時刻BFSA對啤酒蛋白質的吸附量（mg/g）；CT為在t時刻啤酒蛋白質的質量濃度（mg/L）；ΔS為熵變 （J/mol·K）；ΔH為焓變（kJ/mol）；ΔG為吉布斯自由能（kJ/mol）。

圖9 BFSA對啤酒蛋白質吸附的lg（qT/CT）～1/T關系圖Fig.9 lg （qT/CT）～1/T plots for adsorption of beer protein on BFSA

圖9 是根據式（7）所作的BFSA對啤酒蛋白質吸附的 lg（qT/CT）～1/T關系圖，lg（qT/CT）～1/T呈線性關系，直線斜率為-ΔH/2.303RT，直線截距為ΔS/2.303R，因此直線回歸后可得到吸附焓ΔH和吸附熵ΔS，并得到吉布斯自由能ΔG，計算結果如下表2。

表2 BFSA吸附啤酒蛋白質熱力學參數Table 2 Adsorption thermodynamics parameters of beer protein on BFSA

由表4可知，ΔH為負值，說明BFSA吸附啤酒蛋白質過程是放熱的，吸附溫度越低越有利于吸附。ΔS表示的是系統內微觀粒子的混亂度，吸附過程中系統內部混亂度的降低用系統的熵值的降低來表示，由上表可知BFSA吸附啤酒蛋白質的過程是熵減的過程，說明吸附過程中系統的混亂度在降低。ΔG＞0表明BFSA吸附啤酒蛋白質過程是非自發的。

吸附放熱大小標志著不同的吸附作用力，吸附作用力的種類可分為：化學鍵力大于60 kJ/mol，配體交換和離子作用力為40 kJ/mol，氫鍵力為2～40 kJ/mol，范德華力小于 4.4～8.8 kJ/mol，疏水作用力 4 kJ/mol。由表4得到的ΔH為-6.62 kJ/mol可知該吸附過程放熱為6.62 kJ/mol，主要作用力可能是范德華力和氫鍵和疏水作用力。范德華力是普遍存在的力，結合BFSA的表面官能團對可能存在的氫鍵和疏水作用進行如下推論：（1）脯氨酸是亞氨基酸，上面的N原子含有一對孤對電子，更容易形成氫鍵，故吸附過程是BFSA表面的羥基與脯氨酸上面的N原子形成氫鍵；（2）BFSA表面含有Si-O-Si，非極性官能團具有疏水性，而由于氨基酸鏈中高比例脯氨酸會使蛋白結構變得松散和無序，會呈現出最大的疏水性結合表面，因此吸附過程也可能是BFSA表面疏水官能團與富含脯氨酸蛋白之間的疏水作用。

3 結 語

通過FT-IR測定表明BFSA表明含有OH官能團和Si-O-Si疏水官能團，通過BFSA吸附啤酒蛋白質氨基酸分析，發現BFSA對啤酒混濁敏感蛋白有較好的吸附選擇性。

通過吸附等溫線、動力學和熱力學分析，同時結合氨基酸分析，BFSA吸附啤酒敏感蛋白機理推論如下：（1）BFSA表面羥基和富含脯氨酸蛋白之間的氫鍵作用；（2）BFSA表面Si-O-Si與富含脯氨酸蛋白之間的疏水作用。