小米糙米發芽富集γ-氨基丁酸

寧亞維，劉祥貴，王志新，賈英民

（1.河北科技大學 生物科學與工程學院 /河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學食品學院，北京 102488；3.河北省雜糧研究重點實驗室/河北省農林科學院，河北 石家莊 050035）

γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）是一種非蛋白質氨基酸，由谷氨酸經谷氨酸脫羧酶催化而來，是哺乳動物大腦抑制性神經遞質，參與機體多重代謝活動[1-7]。GABA天然存在于糧食原料中（如豆類、蕎麥、大麥、大米等），但含量均較低，然而可以通過環境條件脅迫、微生物發酵、蛋白質水解結合酶催化等手段富集[8-12]，因此目前糧食作物中GABA的富集成為研究的熱點。

小米糙米在發芽過程中內源酶 （如蛋白酶、谷氨酸脫羧酶等）被激活，可以催化谷氨酸進行脫羧反應生成GABA；相反，GABA也會在GABA轉氨酶的作用下分解生成琥珀酸半醛，因此只有谷氨酸脫羧酶的活性超過γ-氨基丁酸、丙酮酸轉氨酶時，γ-氨基丁酸的含量才會增加[13-14]。不同的溫度、發芽時間等發芽條件會影響GABA的生成與降解平衡，只有適宜的條件才會使得小米糙米中的GABA得到有效富集[15]。因此，作者擬以GABA生成量為指標，通過單因素試驗結合響應面優化法探尋小米糙米發芽的最佳條件，以期獲得富集GABA的最佳工藝，為小米產品的開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冀谷：河北省農林科學院谷物研究所提供；GABA標準品：購自Sigma-Aldrich公司；無水乙醇、苯酚、次氯酸鈉、四硼酸鈉、硼酸等均為分析純：購自天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Evolution 220紫外分光光度計：美國Thermo公司產品；SIGMA3-18K高速冷凍離心機：德國SIGMA公司產品；Lab dancer漩渦振蕩器：德國IKA產品產品；SPX-150B-Z型生化培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠產品。GZX-9140MBE礱谷機：上海博訊實業有限公司醫療設備廠產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 小米糙米發芽工藝 首先挑選顆粒飽滿的冀谷19號谷子進行礱谷，人工去除雜質及顆粒不完整的糙米，制備得到實驗可用的小米糙米。然后采用蒸餾水清洗去除雜質，質量分數0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min，再用無菌水清洗殘余次氯酸鈉對小米糙米進行消毒處理。之后于試驗設定條件下進行浸泡與發芽，其中發芽階段每隔12 h采用無菌水淋洗一次。最后于80℃條件下干燥2 h，粉碎待用。

1.3.2 GABA的提取與測定 準確稱取5.0 g小米糙米粉置于三角瓶中，首先加入15 mL無水乙醇提取糙米中的黃色素，于60℃水浴保溫2 h，然后于8 000 r/min離心20 min，上清液即為黃色素提取液，將其棄去留取沉淀物。向沉淀物中加入20 mL去離子水并置于震蕩水浴中提取GABA，在40℃的溫度下震蕩（150 r/min）提取1 h。然后將粗提取液于10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液并定容至25 mL，所得溶液即為GABA提取液。

采用比色法測定GABA質量分數。首先，量取0.4 mL提取液，向其中加入0.6 mL濃度為0.2 mol/L的硼酸緩沖液（pH 9.0）、2 mL苯酚溶液（體積分數6%）和1 mL有效氯為質量分數9%的次氯酸鈉，震蕩均勻。然后于沸水浴加熱5 min，取出后立即置于冰浴中冷卻5 min，待出現藍綠色后加2 mL無水乙醇（體積分數60%），震蕩均勻并測定645 nm處的吸光值。

1.3.3 發芽條件優化與設計

1）單因素試驗 小米糙米發芽試驗中設定浸泡溫度、浸泡時間、發芽溫度和發芽時間4個因素，以發芽小米糙米中GABA質量分數為考察指標進行單因素試驗。

2）優化試驗 在單因素試驗基礎上，選取浸泡溫度、浸泡時間和發芽溫度3個主要影響為自變量，以GABA含量為響應值，設計3因素3水平響應面分析實驗。其中3個自變量的范圍及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken響應面設計試驗因素水平及編碼Table 1 Factor level and code of Box-Behnken design

1.3.4 統計分析 采用origin 8.5進行數據處理及圖表繪制，采用Design-Expert 7.0統計軟件做方差分析與響應面分析。

2 結果與分析

2.1 浸泡溫度對GABA質量分數的影響

分別設定小米糙米的浸泡溫度為：25、30、35、40℃，浸泡時間8 h，每隔2 h更換浸泡液一次，發芽溫度為30℃，發芽時間為48 h。小米發芽糙米的GABA含量如圖1所示。可以看出，浸泡液溫度在25到35℃之間，小米發芽糙米中的GABA含量隨著浸泡溫度的升高而增加，浸泡溫為在35℃時小米發芽糙米中的GABA質量分數達到最大值78.60 mg/hg；當浸泡溫度增加為40℃時，GABA小米發芽糙米中的含量不但沒有增加反而還有所降低。因此，實驗將小米糙米發芽的最佳浸泡溫度選定為30～40℃。此外，未發芽的糙米GABA質量分數為21.90 mg/hg，此研究表明浸泡能夠顯著提高糙小米中GABA質量分數。

圖1 浸泡溫度對GABA質量分數的影響Fig.1 Effect of soaking temperature on the content of GABA

2.2 浸泡時間對GABA質量分數的影響

分別設定浸泡時間為：0、4、8、12、16、20 h，浸泡液溫度為35℃，其他條件為發芽溫度30℃，發芽時間48 h。小米發芽糙米中GABA質量分數如圖2所示。由圖2可知，隨著小米糙米浸泡時間的延長，小米發芽糙米中GABA質量分數呈現先增加后減少的變化趨勢，當浸泡時間為12 h時，GABA質量分數最高可達101.15 mg/hg。因此，將小米糙米的最佳浸泡時間選定為8～16 h。

2.3 發芽溫度對GABA質量分數的影響

分別設定發芽溫度為：25、30、35、40 ℃，浸泡液溫度為35℃，浸泡時間12 h，發芽時間為48 h。小米發芽糙米中GABA質量分數如圖3所示。由圖3可知，在35℃之前，小米發芽糙米中GABA質量分數隨溫度的升高而增加，在35℃時，小米發芽糙米中的GABA質量分數最高為118.82 mg/hg，但溫度在超過35℃后，GABA質量分數隨溫度的升高而降低。因此，選取最佳發芽溫度為30～40℃。

圖2 浸泡時間對GABA質量分數的影響Fig.2 Effect of soaking time on the content of GABA

圖3 發芽溫度對GABA質量分數的影響Fig.3 Effect of germination temperature on the content of GABA

2.4 發芽時間對GABA質量分數的影響

分 別 設 定 發 芽 時 間 為 ：12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h，浸泡液溫度為 35 ℃，浸泡時間為12 h，發芽溫度為35℃。小米發芽糙米中GABA含量如圖4所示。由圖4可知，隨著小米糙米發芽時間的延長，GABA富集量逐漸增加，且在24 h到60 h之間GABA質量分數增長迅速，當發芽時間達到60 h時，GABA質量分數達到峰值181.34 mg/hg。因此，選取最佳發芽時間為48～72 h。

2.5 響應面分析

根據單因素試驗結果，響應面優化試驗設定浸泡溫度 30～40 ℃，浸泡時間 8～16 h，發芽溫度 30～40℃，發芽時間60 h，采用Box-Behnken響應面設計法，優化影響小米糙米富集GABA的關鍵工藝條件。試驗設計及結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

圖4 發芽時間對GABA質量分數的影響Fig.4 Effect of germination time on the content of GABA

經分析得到的小米糙米發芽條件與小米發芽糙米中GABA含量間的二次多項式回歸模型為：Y=178.74-17.20A+9.18B-21.27C+9.92AB-8.56AC-2.61BC-43.91A2-49.56B2-67.20C2，其中A為浸泡溫度，B為浸泡時間，C為發芽溫度。

由上述表3的方差分析結果可知，模型水平顯著，失擬項水平不顯著，表明本試驗建立的回歸模型能真實地描述小米糙米在發芽過程的GABA含量與發芽條件之間的規律。其中C2對發芽小米糙米中GABA質量分數影響極顯著，A2、B2對發芽小米糙米中GABA質量分數影響顯著，AB、AC、BC發芽小米糙米中GABA質量分數影響不顯著。因此，該模型可用于預測小米糙米在發芽中GABA質量分數。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface design experiments and the corresponding GABA contents

通過優化分析得到小米糙米發芽的最佳的工藝條件為浸泡溫度設定在34.14℃、浸泡時間設定12.32 h、發芽溫度設定為34.26℃，在上述條件下發芽60 h，小米發芽糙米中GABA質量分數模型預測值為182.17 mg/hg。依據模型優化結果與實際情況，浸泡溫度選定為34℃、浸泡時間選定為12 h、發芽溫度選定為34℃，發芽60 h對模型進行驗證，結果小米發芽糙米中GABA質量分數為184.75 mg/hg，與預測值擬合度為101.42%，說明模型驗證良好。該優化工藝較優化前提高了2.76倍，較未發芽前提高了8.44倍。因此，該研究表明優化后的發芽工藝能夠有效地提高小米糙米中GABA的富集量。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA） for response surface quadratic model

3 結 語

通過單因素試驗和響應面優化試驗，確立了小米糙米富集GABA的發芽工藝條件：浸泡溫度34℃、浸泡時間12 h、發芽溫度34℃和發芽時間60 h，在此優化條件下小米發芽糙米中GABA質量分數達到184.75 mg/hg，較未發芽前提高了8.44倍。