脫鈣程度對濃縮乳蛋白功能性質的影響

劉大松，余 韻 ，李珺珂 ，徐雨婷，王 淼，周 鵬 *

（1．江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2．食品科學與技術國家重點實驗室 江南大學，江蘇 無錫 214122）

濃縮乳蛋白 （milk protein concentrate，MPC）是牛乳先經脫脂處理，然后經超濾和洗濾脫除部分乳糖和鹽之后，再通過真空濃縮和噴霧干燥脫水，所得到的一類高蛋白粉，其蛋白質的質量分數在40～90%之間[1-2]。MPC具有高蛋白質、低脂肪、低乳糖等特點，并具有良好的風味和口感，是酸奶、乳酪、嬰幼兒食品、烘焙食品、運動營養(yǎng)食品、功能性飲料等食品的重要蛋白質配料[3-4]。MPC在食品中的具體應用是由其特有的功能性質所決定的，比如MPC中的酪蛋白分子具有無序的展開結構，并具有嵌段式的疏水和親水區(qū)域，對液—液和氣—液等界面的形成和穩(wěn)定具有促進作用，因而MPC具有較好的乳化性和起泡性，可用于冰淇淋、慕斯蛋糕、攪打奶油、蛋奶酥等食品的研發(fā)和生產。此外，MPC的蛋白質組成與牛乳幾乎完成相同，即主要含酪蛋白與乳清蛋白，且兩者的質量比例約為4∶1，因而MPC可用于強化酸奶、乳酪等乳制品的蛋白組成，促進其在生產過程中凝膠結構的形成，從而提高最終產品的品質和得率等。

膜分離工藝具有非熱、高效等特點，因而MPC能較好地保持了牛乳中蛋白質原有的結構和性質。MPC中主要的蛋白質是以酪蛋白膠束的形式存在的，膠束的結構特性決定了MPC的功能性質，而酪蛋白膠束的結構又受體系中鈣的含量和存在狀態(tài)的調控。目前，MPC在應用過程中存在的一個突出問題是其溶解性較差，而且蛋白質含量越高和貯藏時間越長，其溶解性較差的問題越嚴重[3，5-7]。MPC良好的溶解性是實現凝膠性、乳化性、起泡性等其它功能性質的先決條件，在工業(yè)生產中，通常要求MPC在常溫條件下能夠快速和完全的溶解[4]。前期研究表明，MPC溶解性較差的主要誘導機理是蛋白非共價聚集，即MPC中的鈣離子會通過離子鍵介導蛋白質之間產生非共價交聯(lián)，從而降低MPC的溶解度，而適當程度的脫鈣預處理能提高MPC的溶解性和貯藏穩(wěn)定性[7-10]。然而，脫鈣預處理對MPC其它功能性質的影響卻有待于進一步研究。

因此，作者以脫脂乳為原料，通過超濾、洗濾、離子交換脫鈣和噴霧干燥，制備系列脫鈣程度的MPC，探討脫鈣程度對MPC功能性質的影響，為調控和拓展MPC的功能性質提供理論依據，從而促進MPC在食品中的廣泛應用。基于MPC在食品中的主要應用范圍，作者在對脫鈣MPC主要理化特性和功能特性（起泡性和起泡穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性）測定的基礎上，進一步對脫鈣MPC的凝膠流變、質構特性和微觀結構特性及鈣離子對其影響，進行了初步的探索研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴氏殺菌脫脂乳：上海光明集團產品；羅門哈斯Amberlite SR1L Na樹脂：美國Dow’s化學品公司產品；異硫氰酸熒光素 （FITC）、葡萄糖酸內酯（GDL）：美國Sigma公司產品；玉米胚芽油：西王集團有限公司產品。

1.2 主要儀器

SPPM-24S-1超濾系統(tǒng)：廈門三達膜科技有限公司產品；Spectr AA 220原子吸收光譜分析儀：美國Varian公司產品；B-290噴霧干燥儀：瑞士步琪公 司 產 品 ；HAAKE MARS Ш 流 變 儀 、Heraeus Multifuge XIR冷凍離心機：美國Thermo公司產品；TA-XT2質構分析儀：英國Stable Micro Systems公司產品；LSM-780激光共聚焦顯微鏡（CLSM）：德國Zeiss公司產品；TM3030臺式掃描電子顯微鏡（SEM）：日本日立公司產品；UV-2700紫外可見分光光度計：日本島津公司產品；T10高速分散機、T25高速分散機、C-MAG HS7磁力攪拌器：德國IKA集團產品；K1302凱氏定氮儀：上海晟聲自動化分析儀器有限公司產品；SHP-250生化培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 脫鈣MPC的制備 在脫脂乳中加入質量分數0.01%疊氮化鈉以防止微生物生長，采用截留相對分子質量10 000的聚醚砜濾膜進行超濾，待體積濃縮3倍后，在截留液中補加水至原脫脂乳體積，經洗濾濃縮3倍后，再在相同條件下重復上述洗濾步驟2次，收集最終所得的截留液，并加入質量分數0.01%疊氮化鈉。取1 kg截留液分別加入0、10、20、30、40 g離子交換樹脂，在室溫下攪拌2 h，然后在進口溫度135℃和出口溫度75℃的條件下進行噴霧干燥，收集MPC置于鋁箔袋中。

1.3.2 總鈣質量分數的測定 稱取0.1 g脫鈣MPC至250 mL高腳燒杯中，加入20 mL濃硝酸和5 mL高氯酸，高溫消化至剩余體積約為2 mL，用超純水定容至50 mL，取5 mL定容后樣品與1 mL鑭溶液（50 mg/mL）一起定容至50 mL，然后再采用原子吸收光譜法測定鈣含量[11]。

1.3.3 總蛋白質質量分數的測定 稱取0.2 g脫鈣MPC、0.2 g硫酸銅、4 g硫酸鉀于消化管中，加入20 mL濃硫酸，高溫消化至澄清透明。采用凱氏定氮法測定脫鈣MPC中的總蛋白質含量，所用的蛋白質換算系數為6.38。

1.3.4 起泡性和起泡穩(wěn)定性分析 稱取5 g脫鈣MPC，加入100 mL超純水，配制為5 g/dL的溶解液，25℃攪拌2 h后，在4℃冰箱中靜置過夜。取5 mL溶解液置于15 mL刻度試管中，記錄溶解液高度，然后用T10高速分散機和S10N-10G分散刀頭（7.6 mm轉子直徑）在30 000 r/min下均質30 s，記錄泡沫初始高度，待靜置30 min后，記錄泡沫終止高度，所得泡沫初始高度與溶解液高度的百分比即為起泡性，泡沫終止高度與泡沫初始高度的百分比即為泡沫穩(wěn)定性[12]。

1.3.5 乳化性和乳化穩(wěn)定性分析 取1.3.4中脫鈣MPC的溶解液20 mL，置于50 mL燒杯中，加入5 mL玉米胚芽油，然后用T25高速分散機和S18N-19G分散刀頭（12.7 mm轉子直徑）在11 200 r/min下均質2 min，立即取10 μL乳狀液加入到5 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.0、質量分數 0.1%SDS）中，混合均勻后置于1 cm寬度的比色皿中，在500 nm波長處測定其吸光度值。乳液靜置20 min后，再在相同條件下測定其吸光度值。乳化性和乳化穩(wěn)定性的計算采用Manoi的方法[13]。

1.3.6 凝膠特性分析

1）凝膠的流變學性質分析 按照1.3.4中的方法配制兩組脫鈣MPC的溶解液（質量分數5%），在一組中添加氯化鈣，使脫鈣MPC溶解液中的鈣含量與未脫鈣MPC的溶解液相同。將溶解液置于95℃水浴中加熱10 min，冷卻至40℃，加入1 g/dL的葡萄糖酸內酯（GDL），攪拌2 min，取1 mL樣品置于流變儀測試平臺上，使用3.5 cm直徑的探頭進行動態(tài)振蕩測試，測試頻率為1 Hz，應變?yōu)?%，測試過程包含4個步驟：酸化階段，40℃保持240 min；冷卻階段，樣品以1℃/min的速度降溫至10℃；退火階段，10℃保持30 min；加熱階段，樣品以1℃/min的速度升溫至40℃[14]。同時，另取加入GDL的溶解液，置于40℃水浴中保持240 min，測定pH值的變化。

2）凝膠的質構特性分析 加入GDL的脫鈣MPC的溶解液15 mL，置于25 mL平底燒杯中，40℃水浴中保持240 min，然后放入4℃冰箱，貯藏過夜后測定凝膠的質構特性，采用12.5 mm直徑的圓柱形探頭，下壓速度為1 mm/s，下壓位移為10 mm。在力與時間的關系曲線上，下壓過程中的第一個破裂點所對應的力即為凝膠斷裂力，最大下壓程度所對應的力即為凝膠強度[14]。

3）凝膠的持水力分析 加入GDL的脫鈣MPC的溶解液5 mL，置于15 mL離心管中，40℃水浴中保持240 min后于4℃冷藏過夜，在500 g和4℃條件下離心10 min，棄去上清后，所得剩余物的質量占凝膠初始質量的百分比即為持水力[14]。

4）凝膠的CLSM分析 加入GDL的脫鈣MPC的溶解液，采用FITC（0.01 mg/mL）標記，然后取200 μL標記樣品置于玻底培養(yǎng)皿中，蓋上蓋玻片，以AB膠密封，并包裹錫箔紙，避光放置于40℃培養(yǎng)箱中保持240 min，4℃冷藏過夜，然后在488 nm激發(fā)波長下觀測凝膠的微觀結構[15]。

5）凝膠的SEM分析 按照1.3.6.2中的方法制備凝膠，并將其切成1 mm3的立方塊，用體積分數2.5%戊二醛在4℃固定過夜，然后用1%四氧化鋨在4℃固定2 h，再用體積分數50%、70%、90%和100%乙醇梯度脫水，臨界點干燥后將樣品置于貼有導電膠的載物臺上，噴金后于15 kV加速電壓下觀測凝膠的微觀結構。

2 結果與討論

2.1 脫鈣MPC的基本組成

如表1所示，脫脂乳通過超濾、洗濾、離子交換脫鈣和噴霧干燥等不同系列工藝處理后，各脫鈣MPC的鈣質量分數分別為27%、24%、22%、20%和17%，脫鈣率分別為0%、11%、19%、27%和37%。各脫鈣MPC的蛋白質質量分數約為78%，對應于食品工業(yè)中常用的MPC80。

表1 脫鈣MPC的基本組成Table 1 Composition of decalcified MPC

2.2 脫鈣MPC的起泡性和起泡穩(wěn)定性

泡沫是由連續(xù)的水相和分散的氣相組成。蛋白質的起泡性是指蛋白質降低氣-液界面的界面張力而促進泡沫形成的能力。MPC的起泡性是決定攪打奶油、冰淇凌、蛋糕等泡沫型乳制品品質的關鍵因素，微細的空氣泡能賦予產品獨特的質構和口感。MPC的起泡性和起泡穩(wěn)定性隨脫鈣程度的變化如圖1所示。從圖中可以看出，起泡性隨脫鈣程度的增加而逐漸提高；起泡穩(wěn)定性在脫鈣率0～11%之間快速增加，在脫鈣率11%～37%之間則緩慢增加。

圖1 脫鈣MPC的起泡性和起泡穩(wěn)定性Fig.1 Foamability and foam stability of decalcified MPC

2.3 脫鈣MPC的乳化性和乳化穩(wěn)定性

一些天然和加工食品，如牛乳、奶油、人造奶油、蛋糕等，都是乳狀液類型的食品。乳狀液為熱力學不穩(wěn)定體系，在貯藏過程中會發(fā)生相分離、絮凝、聚集等現象，蛋白質具有兩親特性，能起到乳化劑的作用，從而降低水油之間的界面張力。MPC的乳化性和乳化穩(wěn)定性隨脫鈣程度的變化如圖2所示。從圖中可以看出，乳化性隨脫鈣程度的增加而逐漸提高；乳化穩(wěn)定性在脫鈣率0～19%之間保持幾乎不變，在脫鈣率19%～37%之間則快速增加。

圖2 脫鈣MPC的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.2 Emulsifiability and emulsion stability of decalcified MPC

MPC中的酪蛋白主要是以球狀膠束聚集體的形式存在的，膠束的粒徑約為100 nm，膠束結構的完整性主要由膠體磷酸鈣和疏水相互作用維持。酪蛋白都是磷酸化的蛋白，在膠束結構中，其磷酸基團與膠束鈣之間相互作用形成離子鍵，從而起到維持膠束結構的作用。當脫脂乳的超濾截留液經過離子交換處理后，酪蛋白膠束中的鈣離子被逐漸脫除，維持膠束結構的離子鍵被破壞，帶負電的磷酸殘基之間產生靜電斥力，因而膠束結構逐漸被破壞，酪蛋白逐漸從膠束中解離，以單分子和小相對分子質量聚集體的形式存在[16]。相比酪蛋白膠束，單分子和小相對分子質量聚集體的酪蛋白能更快速地遷移到兩相界面，更快速地展開并在界面上定向，更快速地在界面上與鄰近分子之間發(fā)生相互作用，形成穩(wěn)定的界面膜，從而更快速地降低界面張力，促進兩相體系的分散，并提高兩相體系（如泡沫和乳狀液）的熱力學穩(wěn)定性。

2.4 脫鈣MPC的凝膠性

2.4.1 凝膠的流變學性質 脫鈣MPC凝膠的流變學性質測試模擬了酸奶從生產、貯藏、到食用的整個過程，分為4個步驟：酸化階段，摸擬酸奶的發(fā)酵過程；冷卻和退火階段，模擬酸奶的后熟和貯藏過程；加熱階段，模擬酸奶入口食用的過程。

在動態(tài)振蕩測試過程中，脫鈣MPC凝膠的儲能模量隨時間和脫鈣程度的變化如圖3（a）所示。在加入GDL的酸化階段，即0～240 min之間，體系溫度保持在40℃，體系pH逐漸從6.74降到4.54，儲能模量隨時間逐漸增加。MPC中主要的酪蛋白為αs1、αs2、β、κ，其等電點分別為 4.4～5.0、4.9～5.0、5.2～5.4、5.4～5.6，因而隨著體系 pH 值的降低，酪蛋白分子所帶的凈電荷逐漸減少，蛋白質分子之間的相互作用逐漸增強，產生蛋白聚集，并最終形成凝膠網絡結構，因而儲能模量逐漸增加。在冷卻階段，即250～270 min之間，體系溫度從40℃降到10℃，儲能模量隨時間快速增加。在退火階段，即270～300 min之間，體系溫度保持在10℃，儲能模量隨時間變化不明顯。在加熱階段，即300～330 min之間，體系溫度從10℃升到40℃，儲能模量隨時間快速降低。在加熱階段結束時，脫鈣MPC凝膠的儲能模量略高于酸化階段結束時的儲能模量，說明經歷冷卻和退火階段的熟化后，凝結的網絡結構更穩(wěn)固。

在動態(tài)振蕩測試的4個階段，脫鈣率越高，凝膠的儲能模量越低，這可能是因為鈣離子的存在能夠介導蛋白分子之間產生交聯(lián)，并促進凝膠網絡結構的形成。雖然前期研究表明適當程度的脫鈣預處理能提高MPC的溶解性，但其凝膠性和貯藏穩(wěn)定性降低[7-10]。然而，在工業(yè)生產中，通常要求MPC在常溫條件下能夠快速和完全的溶解。因此，可在脫鈣MPC的溶解液中回補鈣離子，使其鈣含量與未脫鈣MPC的溶解液相同，以探究儲能模量的回復程度。脫鈣MPC在回補鈣后，其凝膠的儲能模量隨時間和脫鈣程度的變化如圖3（b）所示。對比回補鈣前后的凝膠，可以發(fā)現在動態(tài)測試的4個階段，其儲能模量隨時間而變化的趨勢基本相同，但回補鈣能顯著回復其凝膠的儲能模量，而且脫鈣率越低，儲能模量回復到的水平越高，其中11%脫鈣率的MPC的儲能模量完全回復到了脫鈣之前的水平。

圖3 脫鈣MPC在回補鈣前后其凝膠的儲能模量（G’）變化圖Fig.3 Changes in elastic modulus of decalcified MPC colloids/gels without and with calcium supplement

2.4.2 凝膠的質構特性和持水力 在回補鈣前后，脫鈣MPC的溶解液經酸化和熟化后，所得凝膠的斷裂力、強度和持水力如表2所示。在回補鈣前，MPC凝膠的斷裂力和強度隨脫鈣程度的增加而逐漸降低；在回補鈣后，凝膠斷裂力和強度都得到了顯著的回復，而且脫鈣率越低，斷裂力和強度回復到的程度越高，但仍略低于脫鈣之前的水平。此外，在回補鈣前，MPC凝膠的持水力也隨脫鈣程度的增加而逐漸降低；在回補鈣后，凝膠持水力也得到了顯著的回復，而且脫鈣率越低，持水力回復到的程度越高，其中11%脫鈣率的MPC的持水力完全回復到了脫鈣之前的水平。

2.4.3 鈣離子對MPC凝膠的組織結構的影響 對不同鈣含量（即回補鈣前后）的MPC的葡萄糖酸內酯凝膠組織結構進行了熒光顯微和掃描電鏡超微結構的對比觀察。

在回補鈣前后，脫鈣MPC的溶解液經酸化和熟化后，通過激光共聚焦顯微鏡 （Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）對所得凝膠的網絡結構熒光顯微觀察結果如圖4所示。圖片中的綠色區(qū)域對應乳蛋白，黑色區(qū)域對應水相。從圖片上可以看出，未脫鈣MPC的凝膠，其網絡結構致密均勻。在回補鈣前，隨著脫鈣率的增加，MPC凝膠中的空隙逐漸變大且數量逐漸增加，凝膠網絡結構逐漸變得疏松。在回補改后，MPC凝膠變得致密緊實，其孔隙率顯著降低，凝膠的網絡結構得到了顯著的回復，而且脫鈣率越低，凝膠網絡結構回復到的水平越高，其中11%～19%脫鈣率的MPC凝膠基本回復到了未脫鈣MPC的凝膠網絡結構（圖4）。這也解釋了MPC凝膠的儲能模量、斷裂力、強度和持水力，隨脫鈣率的變化趨勢以及在回補鈣前后的變化，即凝膠的網絡結構越致密、穩(wěn)固，其儲能模量、斷裂力、強度和持水力越大。

在回補鈣前后，脫鈣MPC的溶解液經酸化和熟化后，所得凝膠的微觀結構在掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）下的觀察結果如圖5所示。相比CLSM，SEM能更好的展現MPC凝膠的細微結構。從圖中可以看出，未脫鈣MPC的凝膠中，蛋白質分布均勻，凝膠結構致密。在回補鈣前，隨著脫鈣率的增加，凝膠孔隙率逐漸升高，凝膠結構逐漸變得疏松和粗糙。在回補改后，MPC凝膠的孔隙率顯著降低，凝膠的結構得到了顯著的回復；而且脫鈣率越低，補加鈣后MPC凝膠網絡結構回復到的水平越高，其中11%～19%脫鈣率的MPC凝膠基本回復到了未脫鈣的MPC凝膠結構。這一結果與CLSM顯示的結果基本一致。

表2 脫鈣MPC在回補鈣前后其凝膠的斷裂力、強度和持水力Table 2 Fracture force，hardness and water hold capacity of decalcified MPC gel without and with calcium supplement

圖4 脫鈣MPC在回補鈣前后其凝膠的CLSM微結構Fig.4 CLSM microstructure of decalcified MPC gel without and with calcium supplement

綜合MPC凝膠流變學性質、質構特性、持水力和微觀結構的結果，可以說明鈣的回補能夠在一定程度上回復脫鈣MPC的凝膠性，其中11%脫鈣MPC的凝膠性能夠基本完全回復到脫鈣之前的水平。這可能是由于鈣離子的回補，增加了脫鈣MPC溶解液中游離鈣離子的含量，也提高了體系的離子強度，從而促進了蛋白質分子之間的交聯(lián)以及凝膠網絡結構的形成。

圖5 脫鈣MPC在回補鈣前后其凝膠的SEM超微結構Fig.5 SEM micrographs of decalcified MPC gel without and with calcium supplement

3 結 語

采用離子交換樹脂對脫脂乳的超濾截留液進行脫鈣預處理，然后再通過噴霧干燥制備了脫鈣率為0%、11%、19%、27%和37%的MPC。MPC溶解液的起泡性和起泡穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性都隨著脫鈣程度的增加而逐漸提高。此外，隨著脫鈣程度的增加，MPC凝膠的儲能模量、斷裂力、強度和持水力均逐漸降低，且凝膠網絡結構逐漸變得疏松和粗糙；在脫鈣MPC的溶解液中回補鈣至未脫鈣MPC的含量時，其凝膠的儲能模量、斷裂力、強度、持水力和網絡結構均得到了顯著的回復，且脫鈣率越低，回復到的程度越高，其中11%脫鈣率的MPC凝膠基本完全回復到了脫鈣之前的水平。這說明離子交換脫鈣可作為一種潛在的手段來調控MPC的功能性質，以拓展其在食品工業(yè)中的應用范圍。