大環糊精的分離、鑒定及應用研究進展

王金鵬 ，夏柳溪 ，孟令儒 ，金征宇 ，范天銘

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 協同創新中心，江蘇 無錫214122；4.牧羊集團有限公司，江蘇 揚州 225127）

環糊精（Cyclodextrins，CD），是由 D-吡喃葡萄糖單元通過α-l，4糖苷鍵首尾相連的環狀化合物的總稱。常見的有6、7和8個葡萄糖單元的分子，分別稱為α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精。大環糊精（cycloamylose，CA）屬于環糊精的一種，之所以稱之為大環糊精，是因為它的聚合度通常在9以上[1]。較大的聚合度使大環糊精的結構不同于常見環糊精的中空桶狀結構，大環糊精的結構具有彈性、柔性和扭曲性，當聚合度足夠大時，大環糊精會呈現出雙環的空腔結構[2-5]，結構見圖1。這些特殊的結構賦予了大環糊精高水溶性、低粘度等優良特性，在食品、醫藥、化妝品等領域具有廣泛的應用前景。

圖1 通過X-射線衍射得到的大環糊精的構象模型Fig.1 Large-cyclodextrin Conformation from X-ray

大環糊精主要由酶法催化淀粉制備而得。酶的來源不同，其催化制備所得大環糊精的產率和聚合度范圍也具有較大差異，雖然人們對于制備某一特定聚合度的大環糊精進行了諸多嘗試和探索，但目前為止，酶法制備所得大環糊精多為一定聚合度范圍大環糊精的混合物，這不僅對進行大環糊精的包埋及應用等方面的研究造成很大的困擾，而且限制了大環糊精工業化進程。

1 大環糊精的分離

1.1 鏈狀和環狀糊精的分離

酶催化淀粉制備大環糊精的產物不僅含有大環糊精，而且含有常見環糊精、鏈狀糊精及低聚麥芽糖等。因此分離大環糊精的第一步，是去除非環狀的組分。由于大環糊精不具備還原末端，不能被β-淀粉酶、異淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等識別末端的淀粉酶類降解，因此將這些酶用于催化大環糊精產物，即可使鏈狀分子降解，從而使得環狀組分得到初步純化。

許燕等人[6]利用異淀粉酶和4-α糖基轉移酶協同催化淀粉制備大環糊精。酶促反應結束后，向反應產物中加入糖化酶作用一段時間，此時鏈狀分子即被降解為葡萄糖，后升溫使其在沸水浴的條件下維持至使糖化酶失活，然后利用無水乙醇對產物進行沉淀，在一定的乙醇體積分數條件下，大環糊精可形成結晶沉淀析出，而葡萄糖不能析出，此時經離心分離即可得到大環糊精。Ueda等人[7]則采用淀粉酶類（葡萄糖淀粉酶類和支鏈淀粉酶）將未成環的糊精降解成極限糊精或葡萄糖，然后利用酵母發酵消耗這些糊精或葡萄糖，再通過有機溶劑選擇性沉淀除去α-環糊精、β-環糊精和γ-環糊精，剩下的就是聚合度不等的大環糊精。

上述方法僅用于鏈狀和環狀糊精的分離，分離得到的大環糊精為一定聚合度范圍的大環糊精混合物，如果需要得到某一特定聚合度的大環糊精，則需要進一步的分離大環糊精混合物，通常需要采用多級色譜分離技術。

1.2 薄層色譜（TLC）法

薄層色譜是常用的分離方法，方法簡單易行，但在糖的分離分析中，TLC所用常規的硅膠板僅用于單糖及低聚糖的分離。有報道表明[8]，用TLC能夠較好地將聚合度17以下的大環糊精進行分離，此時分離所用薄板是經氨基修飾的NH2-Kieselgel薄板，二氧己環與氨鹽水溶液作為展開劑，用體積分數50%的乙醇硫酸溶液顯色，兩次展開，獲得較好的分離效果[9]。此外，楊成等人[10]在制備大環糊精（DP 11～15）時，利用 Bio-Gel P-4（Fine，45～90 μm）柱層析對大環糊精進行分離，柱層析所用硅膠為200～300目的硅膠填料，分離得到的大環糊精的純度在90%左右。

1.3 高效液相色譜（HPLC）法

HPLC分離大環糊精，關鍵因素在于色譜柱和流動相的選擇。淀粉經催化后產生的大環糊精和低聚糖混合物，需要采用凝膠柱進行分離，收集大環糊精組分，再采用反相ODS柱對其分離。如Koizumi等人[11]使用 ODS 柱（YMC-pack A-323-3，250x10 mm）對大環糊精進行分離，采用體積分數3%和4%的甲醇洗脫可分別分離得到聚合度10～11和12～20的大環糊精；采用體積分數6%的甲醇洗脫時可分離得到聚合度21～31的大環糊精。 Endo等人[12-14]在分離聚合度18-21的大環糊精時，先選用制備型的氨基柱 （Asahipak ODS-5251-SS），以體積分數6%的甲醇作為洗脫液對其進行分離，然后利用氨基柱進行分離，用體積分數58%的乙腈作為洗脫液可分別分離得到單一聚合度的大環糊精。Taira等人[15]選擇ODS和氨基柱聯合使用，分別以體積分數6%、8%甲醇和50%乙腈作為洗脫液，可分離得到聚合度36～39的大環糊精。

1.4 高效陰離子色譜（HPAEC）法

HPAEC是用的較多的分離分析大環糊精方法，該方法是利用離子交換色譜原理，使不同聚合度大環糊精經Carbo-Pac-100色譜柱分離后被洗脫的先后順序不同，通過檢測其在溶液中電離質子釋放出的電信號，從而實現對不同聚合度大環糊精進行分離分析。 Koizumi等人[11]分別采用CarboPac-1和CarboPac-100對聚合度9～31的大環糊精和聚合度高至80的大環糊精進行分離分析，分離常用的緩沖液為150 mmol/L的氫氧化鈉和150 mmol/L帶有200 mmol/L硝酸鈉的氫氧化鈉溶液作為洗脫液進行梯度洗脫。

1.5 毛細管電泳（CE）法

毛細管電泳具有較高的靈敏度和較短的分析時間的優點。Kim等人[16-18]利用環糊精可以與芳香類物質形成復合物，在紫外條件下有吸收的原理，對聚合度6～13的環糊精進行了分析和表征。作者利用此原理使得聚合度22～50的大環糊精與碘等形成復合物，在毛細管電泳上分離[19]。運行緩沖液為：0.6 mmol/L 的 I2、3.6 mmol/L KI、80 mmol/L 磷酸緩沖液、pH 5.1，分離電壓10 kV、分離溫度20℃，分離時交替采用0.5 mol/L HCl、超純水、1 mol/L NaOH浸潤10 min，然后用電極緩沖液浸潤5 min后啟動上樣程序，上樣時間8 s，壓力0.8 Pa；檢測496 nm下的吸收光譜圖。 Endo等人[20]利用此方法對可能含有聚合度6～17的大環糊精和幾種藥物的混合物進行分析，淀粉、線性的α-1，4葡萄糖可以直接被檢測出來，大環糊精混合物因濃度過低未被檢測出來。

2 大環糊精的鑒定

2.1 比色法

大環糊精因聚合度較大，具有類似淀粉的性質，能夠與碘包合形成包合物，該包合物具有一定的吸光特性，且其吸光特性與底物的吸光特性有較大的差異，從而能夠實現大環糊精產物的鑒定。因此常利用此原理衍生出的比色法作為檢測相關酶酶活的簡便方法。Wang等人[21]采用單波長分光光度法（SWC）測定4α-糖基轉移酶的總酶活和環化活性。作者研究發現淀粉-碘復合物會對大環糊精的檢測造成一定程度的干擾，進而將單波長比色法延伸，開發了三波長分光光度法（TWC）和正交函數比色法（OFC），此方法比相比于單波長及雙波長法測定精確度高、適應性強，精確度和回收率較高。

2.2 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜法（MALDI-TOF-MS）

MALDI-TOF-MS用于鑒定大環糊精，具有分辨率高、檢測靈敏等優點，通過解析分子離子峰的質核比，計算可得大環糊精產物中的主要組分的聚合度。 Koizumi等人[11]用Vision 2000反射式的陽離子模式的 TOF（Thermo Bioanalysis，UK）對產物大環糊精進行鑒定，離子化過程使用337 nm的氮激光脈沖持續時間為5 ns，2，5-二羥基苯甲酸 （10 mg/mL）作為基質，加速電壓為5 kV，反射電壓為7 kV。MALDI-TOF采用6～10的單激光發射，將基質溶液（0.5 μmL）與樣品溶液（1 mg/mL，0.5 μmL）進行混合，在干空氣的條件下進行質譜分析。作者采用TOF-MS鑒定了制備的 LR-CD，測定所得相對分子質量符合M+2Na-2[19]。

2.3 核磁共振和X-射線衍射法

上述鑒定方法僅能得到大環糊精的聚合度信息，無法分析得到大環糊精具體的結構信息。Gessle[22]等人先采用HPLC的方法分離得到CD26，并利用37.5%的PEG400使其結晶，采用特殊的方法使2分子的CD26含有76.5個水分子，并將其中的595個原子固定，調整分辨率，采用核磁共振、X-射線衍射和人工模擬的方法對大環糊精（CD26）的結構進行了解析，表征了大環糊精結構中扭曲的結構連接點，并指出CD26擁有兩個螺旋環狀結構，且都是左手螺旋，葡萄糖單元上2位O與鄰近葡萄糖單元上3位O之間可形成分子內氫鍵，6位O與第6個葡萄糖單元上的2位或3位O之間形成分子內氫鍵以維持其空腔，空腔內存在一些無序水分子，在扭曲處，葡萄糖單元上3位O與鄰近葡萄糖單元上5位和6位O之間形成分子內氫鍵，從而維持該扭曲結構，總的來說CD26的雙螺旋結構和V型淀粉的結構相似。

3 大環糊精的應用

與其它環糊精相比較，大環糊精具有極強的水溶性、較大的疏水空腔和特殊的柔性結構，因此具有較強的包埋特性，特別是包埋一些相對分子質量較大的客體。經大環糊精的包埋，這些客體分子的溶解性和穩定性會增大、分子的化學反應性能也會有所變化。在食品領域中，大環糊精常常被用作淀粉的回生抑制劑、食品風味的緩釋劑、食品中不良雜味的祛除劑，同時，還可以改變食品的流變學特性、增加食品的營養價值。在醫藥領域，大環糊精可以將布洛芬、氟比洛芬等各種藥物包埋從而增加藥物的穩定性，提高藥物的利用率[23-24]。

3.1 低聚合度大環糊精

通常將聚合度小于10的大環糊精稱之為低聚合度的大環糊精。 Furuishi等人[25]發現CD9能夠對C70增溶，聚合度為10的大環糊精對維生素B具有良好的包埋效果，且容易實現商業化。該團隊同時還研究了CD9對不同客體分子的包埋情況，實驗過程中發現，CD9對藥物地辛高和安體舒有包埋作用且有增溶效果，其增溶能力好于α-環糊精，但不如β-環糊精和γ-環糊精。

3.2 中等聚合度大環糊精

通常將聚合度在10～50范圍內的大環糊精稱之為中等聚合度的大環糊精，此類大環糊精主要用于包埋一些小分子的客體分子。

Larsen等人[26]采用毛細管電泳法，用聚合度10～17的大環糊精包埋一些小分子風味物質，如：丁基-苯甲酸和布洛芬等。實驗結果表明，聚合度為14的大環糊精與丁基-苯甲酸的包埋常數是α-環糊精的1/3，是 γ-環糊精的1/2；聚合物 14～16的大環糊精對布洛芬的包埋常數與α-環糊精和γ-環糊精的包埋常數大小相差不大。Fukami等人[27]研究表明聚合度大于22的環糊精混合物對碳鏃C60具有良好的增溶性。

Kitamura等人[28]采用等溫定量熱的方法研究了聚合度21～32的大環糊精與碘的包埋作用。實驗結果表明，上述聚合度的大環糊精與碘以1∶2的比例形成包合物，但是包合會導致大環糊精分子的靈活度下降，所以體系熵值大幅度降低。Mun等人[29]采用等溫滴定量熱的方法研究了聚合度24～44的大環糊精的包埋情況，實驗結果表明，此范圍內的大環糊精與SDS的包合能力很強，且包合過程伴隨放熱反應。 另有研究表明聚合度22～45的大環糊精能夠促進蛋白折疊，對膽固醇、地高辛、硝酸甘油、制霉菌素等具有較好的穩定性和增溶特性[30，32]。

3.3 高聚合度大環糊精

通常將聚合度大于50的大環糊精稱之為高聚合度的大環糊精，此類大環糊精主要用于包埋相對分質量更大的客體分子。

Takaha等人[31]研究表明，聚合度大于50的環糊精可以對醇類、脂肪酸類進行包埋。Kitamura等人[28]研究了高聚合度的大環糊精可以與丁醇、辛醇和油酸等形成包合物，可以使得8-anlino-naphthalene硫酸的熒光性增強。此外，吳宗帥等人[33]利用相溶解度法證實了大環糊精對染料木苷有增溶的效果，同時證實了有包合物的形成，并且隨著大環糊精濃度的增加染料木苷的溶解度也增加。Taira等人[34]研究表明，大環糊精因為不具有還原末端，通常可以避免被外切淀粉酶如葡萄糖淀粉酶分解，因此可以作為其他酶的包合物。Takaha等人[35]研究表明，大環糊精可以提高許多酶或微生物的反應速率，如脂的水解、脂肪酸的合成和膽固醇的氧化等，Vander Maarel等人[36]已經將大環糊精應用到化妝品中，大環糊精的加入可以控制對皮膚有刺激作用，增加化妝品的透明感，避免體系的水油分離的現象。

4 結語

大環糊精因其聚合度的不同而大小不一，結構各異，但其較大疏水柔性空腔結構可用于包合成分復雜特別是大分子的物質。由于大環糊精具有較高的水溶性、低粘度和不回生的特性，在食品、化工、化妝品、醫藥等領域中具有廣泛的應用前景。但是，大環糊精的制備和分離的過程還處于實驗室研究階段，單一聚合度大環糊精的分離無法在工業規模中實現，但不同聚合度的大環糊精混合物所表現出的良好包埋優勢為大環糊精的應用提供了一個新的方向，即采用方便快速的方法實現鏈狀和環狀糊精的分離，并將不同聚合度大環糊精混合物用于客體分子的包埋過程，這樣能夠更快的促使大環糊精的規模化生產，滿足市場對大環糊精需求。