茜草總蒽醌對環(huán)磷酰胺誘導小鼠白細胞降低的保護作用及其作用機制

張振巍，崔璀，張娜娜

(1.中國人民解放軍第一五五中心醫(yī)院，河南 開封 475003； 2.河南應用技術職業(yè)學院，河南 開封 475000； 3.開封市中醫(yī)院，河南 開封 475000)

白細胞減少在臨床放、化療中較為常見，治療中多采用粒細胞集落刺激因子類藥物，但該類藥物價格昂貴，不良反應較大，可引起骨痛、發(fā)熱、白細胞減少等不良反應，有些藥物還可能刺激某些惡性腫瘤的生長。因此，尋找治療白細胞減少癥的低毒高效藥物成為近幾年研究的熱點。植物多糖類大分子成分能激活免疫受體，提高機體免疫能力，并且毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好,在臨床研究中得到深入發(fā)展。為拓展植物藥在臨床的應用范圍，中藥組分對機體免疫的作用在近幾年研究中逐漸深入，但也有些非多糖類成分對白細胞減少癥有著積極的治療作用，如雞血藤[1]有效部位群(總黃酮類成分)在4.05 g/kg的給藥劑量以上對環(huán)磷酰胺(CTX)致白細胞低下的大鼠有較好的升白作用，與空白組比較無統(tǒng)計學意義，說明雞血藤黃酮類成分能有效拮抗免疫抑制大鼠的白細胞減少。六月青皂苷類成分可顯著提高CTX免疫抑制模型小鼠的特異性及非特異性免疫反應，提高其免疫力[2]。前期研究中,課題組發(fā)現茜草總蒽醌(TAR)能明顯促進機體免疫、延長免疫抑制小鼠生存時間，基于此，本研究從保護白細胞減少為基礎，探討茜草總蒽醌對環(huán)磷酰胺誘導小鼠白細胞降低的保護作用及其可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

昆明種小鼠18～22 g，購自河南省動物實驗中心。雌雄各半。實驗動物許可證號:SCXK(豫)2013-0002，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，溫度控制在19℃～25℃，相對濕度為30%～70%。

1.2 藥品與試劑

環(huán)磷酰胺注射液(CTX，江蘇恒瑞藥業(yè)有限公司，批號為H32020857)；大鼠抗小鼠CD34+抗體(美國CALTAG公司)；血清粒細胞集落刺激因子(G-CSF，南京建成生物工程公司，批號為0504191)。地榆升白片(成都地奧集團天麻藥業(yè)股份有限公司，批號為13080627,0.1 g/片)。茜草總蒽醌(Total Anthraquinone ofRubiaCordifoliaL.,TAR)的制備：取茜草飲片500 g，加入10倍量乙醇，連續(xù)回流提取3次，每次1.5 h，減壓回收乙醇，用石油醚萃取，除去醚溶性成分，再將醇濃縮液用氯仿-乙酸乙酯(1:2)萃取2次，合并萃取液，真空干燥即得茜草總蒽醌[3]。

1.3儀器

XSP-C204型生物顯微鏡(重慶光學儀器廠)；AY120電子天平(SHI-MAZDU公司)。

2 方法

2.1 動物分組及模型制備

取小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，分別為正常組、模型組、地榆升白組(簡稱陽性組，臨用前研成細粉，用生理鹽水配制成濃度為0.1 g/15 mL的混懸液，實驗給予100 mg/kg劑量)和茜草總蒽醌高、低劑量組(簡稱高、低劑量組，用量分別為120 mg/kg、60 mg/kg)，除正常組外其余各組小鼠均腹腔注射等劑量的環(huán)磷酰胺100 mg/kg，連續(xù)3天，每天1次，復制白細胞減少動物模型[4-5]。

2.2 外周血WBC測定

小鼠末次給藥后30 min，眼眶靜脈叢取血，按照常規(guī)方法在低倍顯微鏡下計數。

2.3 BMC測定

小鼠脫臼處死，分離并取出右側股骨中斷7 mm，用3%乙酸溶液沖出骨髓細胞，在血細胞計數盤上計數四個大方格的細胞數，然后乘以2.5×104，即得1根股骨中骨髓有核細胞總數[6-7]。

2.4 CD34+細胞檢測

參照文獻[1]方法檢測：用含牛血清白蛋白濃度為0.2 %的磷酸鹽緩沖溶液沖出小鼠左側股骨骨髓細胞，取1×106個細胞加入30 μL正常小鼠血清以封閉非特異結合位點，加入10 μL FITC標記的CD34+抗體，對照管中加入相應的對照抗體，4℃避光反應30 min，加入2 mL紅細胞裂解液，反應5 min后，沖洗2次，加入濃度為3 μg/mL的碘化丙啶染液，采用流式細胞儀進行檢測。

2.5 脾臟指數和胸腺指數檢測

小鼠處死后，取出各組小鼠的脾臟和胸腺，分別稱重后計算臟器指數。

臟器指數=臟器重量/體質量

2.6 脾集落形成單位(CFU-S)檢測

參照相關文獻[8-9]，各組小鼠脫臼處死后，取出脾臟，去除筋膜，稱重后固定于Bauin染液中，24 h后鏡下觀察、計數。

2.7 血清G-CSF活性測定

將每組小鼠的血液常溫下靜置30 min后，離心15 min，3 500 r/min，取上清液，按照試劑盒說明測定G-CSF活性。

2.8 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 茜草總蒽醌對CTX致小鼠WBC、BMC細胞及臟器指數的影響

由表1可以看出：模型組的WBC、BMC細胞及臟器指數等指標均低于正常組(P<0.05)，說明CTX對小鼠免疫應答出現抑制狀態(tài)，提示模型復制成功。陽性組和茜草總蒽醌的高、低劑量組對CTX致小鼠WBC、BMC細胞及臟器指數均有不同程度改善，與模型組比較均有顯著性差異(P<0.05)；其中高劑量組的TAR對WBC的恢復能力優(yōu)于BMC，升高免疫抑制小鼠WBC數量與正常組相當，稍低于正常組，統(tǒng)計學對比顯示沒有顯著性差異(P>0.05)；TAR高、低劑量組能顯著對抗CTX致小鼠免疫器官萎縮的癥狀，即提高免疫抑制小鼠免疫器官指數，且高劑量組明顯優(yōu)于低劑量組治療效果(P<0.05)，說明茜草總蒽醌對抗CTX致小鼠白細胞降低呈現劑量依賴作用；提示TAR對免疫器官有較好的保護作用，并能積極恢復CTX致小鼠的免疫抑制狀態(tài)。

表1 各組對CTX致小鼠WBC、BMC細胞及臟器指數影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05。

3.2 茜草總蒽醌對CTX致小鼠CD34+、CFU-S、血清G-CSF的影響

正常狀態(tài)下機體造血主要由骨髓承擔，脾臟只是肩負造血的儲備功能，因此脾臟指數、CFU-S指標并不高，模型組的CFU-S指標較正常組明顯下降(P<0.05)，說明小鼠造血組織大量破壞、萎縮，這與脾臟指數降低相一致。CD34+抗原陽性率反映出小鼠造血干/祖細胞數量的變化，由表2可以看出：陽性組和TAR高、低劑量組均能大幅度的提升CD34+抗原陽性率，高劑量的TAR對其提升水平甚至高于正常組，與正常組比較有顯著性差異(P<0.05)，提示TAR高劑量時能迅速恢復小鼠體內造血干細胞的造血功能，使造血干/祖細胞數量增加；此調控作用與G-CSF響應相一致，從多角度反應了TAR對CTX致小鼠白細胞降低的保護作用可能與其能快速恢復造血干/祖細胞數量，增加CD34+、CFU-S、血清G-CSF指標有關。

表2 各組對CTX致小鼠CD34+、CFU-S、血清G-CSF指標影響

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05。

4 討論

CTX是一種細胞周期非特異性廣譜抗腫瘤藥物和免疫抑制劑，其殺傷腫瘤細胞的同時也可對正常組織細胞造成傷害，如淋巴細胞、造血干細胞等，從而造成免疫功能及造血功能低下。本實驗中，小鼠連續(xù)腹腔注射3天100 mg/kg，小鼠白細胞數、骨髓有核細胞數、免疫器官質量均明顯低于正常組(P<0.05)，說明模型復制成功。地榆升白片是中成藥制劑，君藥是地榆，從其化學成分的角度來看，主要含有皂苷、鞣質、黃酮類成分，具有止血、抗菌消炎、促進傷口愈合等作用。研究表明該制劑能顯著改善骨髓微循環(huán)的造血環(huán)境，促進骨髓造血干細胞增殖及分化，并能顯著改善免疫抑制小鼠的外周血白細胞數量[10]，因此實驗中選擇該成藥作為陽性對照藥物進行實驗。

CD34+是20世紀80年代中期由美國科學家發(fā)現的一種細胞表面分子，其在正常骨髓單個核細胞中約占1%～4%，因此CD34+是造血干細胞特異性的表面標記物，在臨床上，通常采用流式細胞儀對CD34+造血干細胞計數以評估骨髓動員效果[11]。CD34+抗原選擇性表達于小鼠早期造血干/祖細胞膜表面，并隨細胞分化成熟而減少至消失，是小鼠造血干/祖細胞的表面標志，其數量的變化能反映出小鼠造血干/祖細胞的數量；從實驗結果來看，模型組CD34+細胞與正常組比較陽性百分率大幅度下降(P<0.05)，說明模型復制成功；高、低劑量的茜草總蒽醌有不同程度的升高CD34+細胞的作用，高劑量的TAR組陽性率較正常組高，提示TAR能增加造血細胞的分化，促進細胞因子分化、成熟[12]。G-CSF是正常造血細胞的增殖分化過程中一種重要的造血正性調控因子，能促進骨髓粒系、單核細胞系、巨噬細胞系發(fā)育和成熟，增加外周血成熟粒細胞、單核巨噬細胞功能的一種細胞因子[13-14]；數據顯示，陽性組和TAR高、低劑量組均能不同程度的提升G-CSF水平，且TAR高劑量組與陽性組作用強度相當，與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；提示TAR能促進造血調控因子的分化，對造血細胞的功能恢復有積極促進作用，提升免疫抑制小鼠的免疫能力，對抗CTX誘導的免疫抑制，這可能是TAR升高白細胞、促進骨髓造血系統(tǒng)恢復的機制之一。

外周血白細胞計數是腫瘤化療過程中常規(guī)檢查指標之一，反映了放療、化療對骨髓的抑制程度和機體免疫狀態(tài)；實驗結果顯示，模型組的WBC計數較正常組低，并有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明模型復制成功。陽性組和高、低劑量的TAR能明顯對抗CTX致小鼠白細胞的降低(P<0.05)，TAR的對抗作用呈現劑量依賴關系。骨髓有核細胞(BMC)包含了粒系、紅系、巨核系的祖細胞，其計數在一定程度上反映了骨髓造血細胞的增生情況，實驗表明，TAR能升高CTX致小鼠的BMC降低，說明TAR可能通過刺激骨髓造血功能增加血液白細胞數量[15]。脾臟、胸腺是機體重要的免疫器官，同時脾臟還有一定的造血功能，當骨髓功能受損時，脾臟可代償性髓外造血。實驗結果表明，TAR高、低劑量組可明顯拮抗CTX導致的小鼠免疫器官質量降低(P<0.05)，提示TAR能促進骨髓造血，對模型小鼠的免疫器官能起到有一定的保護作用。CFU-S是脾臟造血干細胞在脾臟表明產生細小的顆粒狀突擊，即為脾結節(jié)；實驗結果顯示TAR高、低劑量組對造血干/祖細胞的數量和增殖能力有保護作用，這與WBC和BMC檢測結果相一致。

綜上所述，茜草總蒽醌(TAR)可顯著對抗環(huán)磷酰胺誘導的小鼠白細胞降低作用，其作用機制可能與TAR誘導刺激骨髓造血功能恢復，引導造血調控因子分化，增加血液白細胞數量有關；同時TAR還能刺激機體的免疫器官，促進脾臟造血干細胞脾結節(jié)的產生，進而機體自身抵抗力，發(fā)揮對白細胞的保護作用。