HMGB1在呼吸道合胞病毒支氣管肺炎患兒中的作用及機制

胡 俊

云南省第二人民醫院 兒科(昆明 650000)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)是全球嬰幼兒和老年人呼吸道感染的主要誘因，其發生機制、治療手段尚不清楚。高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1, HMGB1)是一種核蛋白，在胰腺炎、膿毒癥、腫瘤、風濕免疫等疾病中高表達，并可分泌到細胞外，發揮致炎作用[1-4]。Toll樣受體4(toll-like receptor, TLR4)是一種重要的免疫識別受體，與外界微生物、藥物等相互作用后，激活核轉錄因子(nuclear factor kappa B, NFκB)，引起下游炎性因子釋放[5-6]。Kaumu等[7-8]發現HMGB1在腺病毒感染、葡萄球菌感染致肺炎中具有重要作用。但目前HMGB1在合胞病毒感染肺炎中鮮有報道，且機制尚不清楚。因此，本研究選取合胞病毒肺炎患兒與健康兒童作比較，明確HMGB1是否通過參與某條與炎癥相關的通路發揮致炎作用，并從細胞水平確定HMGB1在呼吸道合胞病毒支氣管肺炎患兒中的作用及機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年6月至2017年6月在云南省第二人民醫院就診的46例呼吸道合胞病毒支氣管肺炎患兒作為實驗組，其中男23例，女23例，年齡2個月至2歲。選取同期在本院體檢的正常兒童46例作為對照組 ，其中男25例，女21例，年齡2個月至2歲。本文所有臨床操作均獲取知情同意，并經倫理委員會批準。兩組兒童年齡、性別一般資料進行比較，差異無統計學意義 (P>0.05) (表1)。

表1 研究對象基線資料比較

1.2 納入標準與排除標準

納入標準：1)支氣管肺炎患兒：臨床表現為發熱、咳嗽、氣促，肺部固定性的中、細濕啰音，X線檢查，早期見肺紋理增粗，以后出現小斑片狀陰影； 2)呼吸道合胞病毒感染：根據病毒學及血清學進行合胞病毒感染的快速診斷。排除標準： 1)合并有心肝腎等嚴重基礎疾病的患兒； 2)此前就患有肝炎、腎炎等感染疾病或者患有先天性心肺類病癥以及有免疫缺陷病癥的患者； 3)患者的體質為過敏性； 4)患者肺部還存在其他病癥。

1.3 酶聯免疫吸附試驗

采集對照組和實驗組外周靜脈血2 mL于抗凝管，離心分離血漿，置于-80 ℃待測。應用酶聯免疫吸附試驗 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法測定血清中炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、hs-CRP的濃度，實驗步驟根據美國eBioscience試劑盒說明書執行。

1.4 流式分析

采集對照組和實驗組外周靜脈血2 mL于抗凝管，淋巴細胞分離液 (索萊寶)分離單個核細胞。經固定破膜試劑盒 (美國Invitrogen公司)使細胞固定破膜后，用抗TLR4抗體 (英國Abcam公司)和抗NFκB (英國Abcam公司)抗體孵育，流式細胞分析表達TLR4和NFκB的單個核細胞百分比。

1.5 蛋白質免疫印跡

用IP裂解液(thermo fisher scientific)裂解并收集細胞，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒 (上海碧云天生物技術有限公司)檢測總蛋白濃度。加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液 (上海碧云天生物技術有限公司)，100 ℃沸水浴10 min后冰上冷卻。取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，在室溫下用5% 的脫脂奶粉封閉2 h，然后用HMGB1、TLR4、NFκB的一抗4 ℃孵育過夜。PBST洗滌3次后，用對應的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h。洗滌3次后，用ECL顯色液 (上海碧云天生物技術有限公司)顯色，于凝膠成像儀器下曝光和拍照。使用Image J軟件測定灰度值。

1.6 人支氣管上皮細胞NHBE的培養、RSV的培養和RSV感染

人支氣管上皮細胞NHBE的培養：NHBE細胞株購買于中國科學院細胞庫，是一株貼壁細胞，使用10%胎牛血清 (美國Gibco公司)的DMEM培養液(美國Gibco公司)培養于37 ℃、5% CO2培養箱中。RSV的培養：將濾菌處理的RSV接種至培養好的Hep-2細胞擴大培養，吸附2 h后于無血清DMEM中加入3%的胎牛血清培養，觀察細胞生長情況，待80%細胞出現特征性病變時，收集病毒并測定滴度，將滴度稀釋至8～9 log10 PFU/mL，保存于-80 ℃。RSV感染：將NHBE細胞接種于48孔細胞板中，待培養孔中細胞長至80%滿時，接種0.1 mL RSV 病毒，吸附1 h后，于無血清DMEM中加入3%的胎牛血清培養。

1.7 shRNA及質粒轉染

根據GenBank數據庫HMGB1的核苷酸序列，設計合成HMGB1 shRNA序列(shHMGB1)和無義序列 (Scramble)，序列合成于上海生工生物工程股份有限公司，構建于pLKO.1質粒上。質粒轉染24 h前，接種5×105個細胞至6孔細胞培養板培養，轉染30 min前換無血清DMEM培養液培養。將200 μL 無血清DMEM、3 μg質粒、9 μL ViaFect Transfection Reagent (美國Promega)混合，即轉染液，室溫靜置10 min。將轉染液加入至6孔板中，輕輕混勻后放置于細胞培養箱中繼續培養9 h，轉染結束后換用10%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養24 h。隨后，Scramble和shHMGB1轉染的細胞即為無義序列組和HMGB1干擾組(表2)。

表2 shRNA序列

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 兩組兒童血清中炎性因子含量的比較

與對照組相比，試驗組外周血中IL-6、IL-8、TNF-α、hs-CRP表達明顯較高，差異具有統計學意義 (P<0.05)(表3、圖1)。

表3 兩組兒童血清中炎性因子含量的比較

圖1ELISA檢測兩組兒童外周血中促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、hs-CRP的濃度

注：與對照組比較，**P<0.01

2.2 兩組兒童血清中HMGB1含量的比較

LISA檢測兩組兒童血清中HMGB1的濃度，結果顯示試驗組兒童外周血分泌的HMGB1 (55.75±4.23 pg/mL)明顯高于對照組兒童外周血分泌的HMGB1 (15.06±5.68 pg/mL)，差異有統計學意義 (P<0.01)(表3、圖2)。

圖2ELISA檢測兩組兒童血清中HMGB1的濃度
注：與對照組比較，**P<0.01

2.3 兩組兒童外周血單個核細胞TLR4和NFκB的表達比較

在合胞病毒支氣管肺炎患兒外周血中有25%的單個核細胞表達TLR4，是健康兒童組的5倍，差異具有統計學意義(P<0.01)(圖3A)。在合胞病毒支氣管肺炎患兒外周血中有80%的單個核細胞表達NFκB，是健康兒童組的4倍，差異具有統計學意義(P<0.01)(圖3B)。

圖3 流式細胞分析兩組兒童外周血中表達TLR4和NFκB的單個核細胞數量

注：A：TLR4陽性單個核細胞占血漿總細胞百分比，與對照組相比，**P<0.01；B：NFκB陽性單個核細胞占血漿總細胞百分比，與對照組相比，**P<0.01

2.4 HMGB1 shRNA轉染對合胞病毒誘導NHBE細胞TLR4和NFκB表達的影響

與合胞病毒感染的無義序列轉染組比較，合胞病毒感染的HMGB1干擾組TLR4 (t=17.62,P<0.01)和NFκB (t=14.88,P<0.01)表達明顯降低，差異具有統計學意義(圖4A～D)。

圖4 HMGB1干擾組在合胞病毒感染后TLR4和NFκB的表達

注： A：Western blot檢測TLR4的表達; B：Western blot檢測NFκB的表達; C： 灰度分析TLR4的表達水平，與對照組相比較，**P<0.01; D：灰度分析NFκB的表達水平，與對照組相比較，**P<0.01

2.5 合胞病毒誘導支氣管上皮細胞分泌HMGB1和表達TLR4、NFκB

與未用合胞病毒處理的NHBE相比較，合胞病毒感染的NHBE分泌的炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、hs-CRP和HMGB1較高，差異具有統計學意義(表4、圖5A～B)。同時與未用合胞病毒感染的NHBE相比較，合胞病毒感染的NHBE的 TLR4(t=26.10,P<0.01)和NFκB(t=27.23,P<0.01)表達較高，差異具有統計學意義(圖5C～F)。

表4 兩組兒童血清中炎性因子含量的比較

圖5RSV支氣管上皮細胞NHBE感染合胞病毒后HMGB1和炎性因子的分泌以及TLR4、NFκB的表達

注：A：細胞培養上清炎性因子的濃度，與對照組相比較，**P<0.01，*P<0.05；B：細胞培養上清HMGB1的濃度，與對照組相比較，**P<0.01；C：Western blot檢測TLR4的表達；D：Western blot檢測NFκB的表達；E：灰度分析TLR4的表達水平，與對照組比較，**P<0.01；F：灰度分析NFκB的表達水平，與對照組相比較，**P<0.01

3 討論

小兒氣道發育不完全，免疫能力較弱，易受細菌、病毒的感染，誘發肺炎疾病發生[9-10]。 RSV 為引起小兒支氣管肺炎常見的病原微生物之一，屬RNA病毒，可促使Th1/Th2失衡，刺激TNF-α、IL-18等炎性因子的分泌，加重炎癥病情，甚至發展成呼吸循環衰竭，導致小兒死亡[10]。

HMGB1是典型的位于細胞核中的25 kDa DNA結合蛋白，但在翻譯后修飾(如乙?；?、磷酸化和甲基化)之后，它可以轉運到細胞質中，待細胞活化或死亡后被釋放到細胞外[11-12]。HMGB1最初被表征為轉錄因子和生長因子，但后來研究[13-15]發現HMGB1在許多炎癥性疾病中扮演著細胞因子調節劑的角色。在各種RNA病毒 (包括流感病毒H5N1、丙型肝炎病毒、西尼羅病毒、登革病毒和HIV-1)[16-17]和DNA病毒(如單純皰疹病毒2型)[18]的發病機制中，HMGB1的釋放發揮了重要的作用。目前關于HMGB1在合胞病毒支氣管肺炎中研究很少，且機制尚不明確。最近關于HMGB1在哮喘和COPD的研究[19-21]發現HMGB1參與了肺部炎癥的發展過程，為本研究提供了強有力的依據。本研究從生物個體和細胞層面發現，RSV感染誘導HMGB1蛋白從細胞核向細胞質的轉運，并誘導其分泌到胞外環境。并且，RSV感染誘導支氣管上皮細胞導致HMGB1從細胞核向細胞質易位并隨后分泌到細胞外的過程是獨立于細胞死亡而發生的。這是因為本研究在病毒感染的24 h內沒有看到任何明顯增加細胞凋亡、壞死或細胞病變的現象發生。

盡管本研究初步探討了HMGB1在呼吸道合胞病毒支氣管肺炎患兒中的作用及機制，但是仍然有許多不足之處：1)本研究采集了合胞病毒支氣管肺炎患兒的外周血，并對其中的HMGB1、TLR4/NFκB、炎性因子的表達量進行了檢測。但炎癥反應的發生是炎性因子和機體免疫對抗的過程，本研究只涉及了炎性因子的分泌情況，忽略了免疫細胞的浸潤和變化的研究；2)本研究只在一株支氣管上皮細胞進行機制研究，缺乏普遍性；3)本文僅將HMGB進行干擾以研究后續的生物學效應，而干擾TLR4、NFκB又能否達到相同的效應，以及干擾HMGB1再過表達TLR4是否會恢復下游蛋白的表達；4)本文僅在體外細胞水平探討TLR4/NFκB信號通路的作用，實驗結果的穩定性和可靠性均不如動物實驗，因此仍然需要進一步構建體內動物模型以驗證結論。

綜上所述，在本研究中，本研究通過生物個體即合胞病毒支氣管肺炎患兒的外周血樣品發現HMGB1、TLR4/NFκB、炎性因子的正相關關系。進一步從細胞層面證明了合胞病毒感染可同時促進HMGB1、TLR4/NFκB、炎性因子的表達與分泌。因此我們推測HMGB1很可能參與了TLR4/NFκB致炎信號通路，促使炎性因子的分泌增加。合胞病毒感染HMGB1干擾細胞株結果發現，合胞病毒感染不再誘導TLR4/NFκB的表達和炎性因子的分泌。綜上所述，HMGB1及其介導的TLR4/NFκB信號通路在呼吸道合胞病毒支氣管肺炎患兒中高表達，特異性阻斷HMGB1可抑制TLR4/NFκB信號通路，緩解呼吸道合胞病毒誘導支氣管上皮細胞分泌炎性因子。