miR-219-5p, miR-19b-1和miR-25在骨肉瘤患者血清中的表達(dá)以及與肺轉(zhuǎn)移的關(guān)系

牛 敏，吉亞紅，李曉利，晁 杲

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會醫(yī)院 消化內(nèi)科(西安 710054)

骨肉瘤(osteosarcoma, OS)是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，在所有兒童患者中占骨腫瘤的55%[1-2]。近40年來，由于聯(lián)合化療手術(shù)的使用，使得OS的存活率提高了65%左右[3-4]。OS最常見的轉(zhuǎn)移為肺轉(zhuǎn)移，其轉(zhuǎn)移的時間對存活率有明顯影響。診斷時確定為轉(zhuǎn)移瘤的5年存活率為18%，而術(shù)前或術(shù)后發(fā)現(xiàn)為轉(zhuǎn)移瘤的5年存活率僅有0%和6%[5]。也就是說，及早對轉(zhuǎn)移性O(shè)S的確診可以明顯提高其生存率。然而到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)敏感和特異性的非侵入性診斷生物標(biāo)志物來區(qū)分轉(zhuǎn)移性O(shè)S和非轉(zhuǎn)移性O(shè)S之間的差異。

外周血中游離的miRNA作為生物標(biāo)志物具有很好的應(yīng)用前景[6]。它們在體液中很容易被分離和檢測，其化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單且穩(wěn)定，并在物種間高度保守，以組織特異性方式表達(dá)[7]。越來越多的報道[8]顯示，miRNA可作為穩(wěn)定的外周腫瘤標(biāo)記物，如在乳腺癌中，具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者血清miR-10b和miR-373水平明顯高于未轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，表明它們可用作乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。在胃癌中，血清中miR-203水平提示其可能是轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后的生物標(biāo)記因子[9]。有研究[10]顯示，5種血清miRNA(-16、-25、-92a、-451和-486-5p)可能作為胃癌早期轉(zhuǎn)移階段的潛在生物標(biāo)志物。miR-21、-29a、-25、-200a和-486-5p可以作為宮頸癌的生物標(biāo)志物[11]。這些研究均表明了外周血中游離miRNA具有作為癌癥檢測和預(yù)測的潛力分子。

本研究通過探尋OS患者肺轉(zhuǎn)移前后外周血中miRNA的差異表達(dá)，篩選有助于預(yù)測和監(jiān)測肺轉(zhuǎn)移的潛在的miRNA分子。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年4月至2018年4月來自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬紅會醫(yī)院腫瘤外科、西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤外科和西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤外科診斷入院患者。所有樣品的收集和試驗均得到西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理審查委員會批準(zhǔn)并取得病患知情同意書。所有參與本研究的作者和試驗人員均閱讀了世界醫(yī)學(xué)協(xié)會的道德規(guī)范赫爾辛基宣言并嚴(yán)格遵守。按中國臨床腫瘤學(xué)會(CSCO)經(jīng)典型OS診療指南(2018)，納入病例資料完整的OS患者，選擇確診并尚未經(jīng)規(guī)范化綜合治療(包括術(shù)前化療、術(shù)后化療和手術(shù))的88例患者作為本試驗的研究對象。所有患者入院后均行肺部 CT以評估是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。其中，41例OS患者初診前就發(fā)生肺轉(zhuǎn)移侵襲，作為OS肺轉(zhuǎn)組，47例OS患者確診但未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，作為對照組。患者6～64歲，平均23.2歲，男女比例約1.5∶1，對年齡、性別、病程、常規(guī)體格檢查等一般資料進(jìn)行比較，經(jīng)秩和檢驗分析顯示，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩組具有可比性。一旦確診為OS，其血液樣本都被收集并儲存在-80 ℃直至進(jìn)一步處理。

1.2 miRNA微矩陣芯片

使用miRNA微矩陣芯片預(yù)篩選OS未轉(zhuǎn)移(n=6)和OS肺轉(zhuǎn)移(n=6)的靜脈血漿樣品之間的miRNA差異。由于miRNA的組織特異性，將符合以下特征的miRNA作為預(yù)選制作miRNA微矩陣，為小規(guī)模預(yù)篩定制芯片：在OS中明顯上調(diào)的miRNA[12]，在外周血中可檢測到的miRNA[13]，參與OS發(fā)生的miRNA[14]。使用0.22 μm濾過器將250 μL靜脈血血漿樣本進(jìn)行過濾。使用RNAeasyTM小RNA提取試劑盒(碧云天生物科技公司，上海)提取細(xì)胞中總miRNA。總miRNA使用miRCURYTM power labeling kit(Exiqon，丹麥)標(biāo)記并雜交至miRCURY LNA微RNA陣列上(Exiqon，丹麥)。用Axon GenePix 4000B微陣列掃描儀(Moleculardevices，美國)掃描后使用Agilent Feature Extraction v10.7軟件提取數(shù)據(jù)。使用GeneSpring GX v11.5.1對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，用Image GP軟件制作散點火山圖表現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA。用MeV4.9軟件制作熱圖來顯示差異表達(dá)最明顯的30個mRNA及miRNA分子。

1.3 實時熒光定量PCR

qPCR檢測所有OS病人在RNA微矩陣預(yù)篩選的結(jié)果中表達(dá)最明顯的6個miRNA在血漿中的表達(dá)水平。使用RNAeasyTM小RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中總miRNA。通用miRCURYcDNA合成試劑盒(Exiqon.Inc.，丹麥)用于合成第1鏈cDNA。在PTC-100熱循環(huán)儀(Bio-Rad，Inc.，美國)上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃，60 min；85 ℃，5 min。 所得的單鏈cDNA 置于-20 ℃保存)。將4 μL cDNA(在無核酸酶的水中以1∶20稀釋)模板用于qPCR反應(yīng)，加入5 μL PCR SYBR綠色熒光探針和1 μL特異性PCR引物(Exiqon)組成10 μL 反應(yīng)體系。ABI StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)(ThermoFisher Scientific，Inc.，美國)用于miRNA的定量檢測(反應(yīng)條件：預(yù)變性90 ℃，10 min；變性90 ℃，10 S，退火57 ℃，20 s，延伸72 ℃，10 S，40循環(huán)數(shù))。引物序列如下表所示(表1)，U6表達(dá)作為內(nèi)參。

表1 stem-loop RT-PCR及qPCR檢測miRNA所需引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 與OS肺轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA預(yù)篩選

對12例患者(6例OS肺轉(zhuǎn)移)進(jìn)行miRNA差異表達(dá)的預(yù)篩選，在檢測共計95個miRNA中，相比于未轉(zhuǎn)移組OS，肺轉(zhuǎn)移組OS有24個miRNA明顯上調(diào)(改變倍數(shù)>1.5,P<0.01)，23個miRNA明顯下調(diào)(改變倍數(shù)<0.5,P<0.01)(圖1A)。將30個上調(diào)及下調(diào)最明顯的miRNA制作熱圖，相比于未轉(zhuǎn)移OS患者，OS肺轉(zhuǎn)移患者血清中miRNA的表達(dá)水平發(fā)生明顯變化(圖1B)。

圖1RNA微陣列芯片篩選與OS轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA

注：A：95個預(yù)篩選miRNA的火山圖(橫坐標(biāo)為肺轉(zhuǎn)移對比未轉(zhuǎn)移的miRNA表達(dá)量的相對倍數(shù)的Log值，縱坐標(biāo)為-Log2)；B：30個差異表達(dá)最明顯的miRNA表達(dá)值經(jīng)歸一化法處理后制作熱圖，藍(lán)色表示低表達(dá)miRNA，紅色表示高表達(dá)miRNA

2.2 miRNA在肺轉(zhuǎn)OS肺轉(zhuǎn)移患者血清中的差異表達(dá)

qPCR檢查所有OS患者血清miRNA水平，和微陣列芯片結(jié)果一致，miR-219-5p、miR-19b-1及miR-151-3p在OS肺轉(zhuǎn)移患者的外周血漿中相對于未轉(zhuǎn)移OS對照組明顯提高(P<0.05)。而miR-32、 miR-363和miR-25在OS肺轉(zhuǎn)移患者的外周血中相比于未轉(zhuǎn)移OS對照組明顯下調(diào)(P<0.05)。這些結(jié)果提示，miR-219-5p、miR-19b-1、miR-151-3p、 miR-32、miR-363和miR-25可能是調(diào)控OS肺轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子(圖2)。

圖2qPCR檢測與OS轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA

注：A：qPCE檢測OS患者及肺轉(zhuǎn)移患者血清中miR-219-5p的相對表達(dá)水平；B：OS患者及肺轉(zhuǎn)移患者血清中miR-19p-1的相對表達(dá)水平；C：OS患者及肺轉(zhuǎn)移患者血清中miR-151-3p的相對表達(dá)水平；D：OS患者及肺轉(zhuǎn)移患者血清中miR-32的相對表達(dá)水平；E：OS患者及肺轉(zhuǎn)移患者血清中miR-363的相對表達(dá)水平；F：OS患者及肺轉(zhuǎn)移患者血清中miR-25的相對表達(dá)水平

2.3 差異血清miRNA與OS肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

分別將血清miR-219-5p、 miR-19b-1、miR-151-3p、 miR-32、 miR-363和miR-25納入二元Logistic回歸分析的因變量中，肺轉(zhuǎn)移作為自變量。單獨使用miR-219-5p、miR-19b-1、miR-151-3p、miR-32、miR-363和miR-25對OS肺轉(zhuǎn)移的預(yù)測率分別為71%(R=0.223,P=0.017)、63.2%(R=0.071,P=0.015)、 68.4%(R=0.100,P=0.300)、 71.1%(R=0.244,P=0.054)、77.6%(R=0.085,P=0.073)和84.2%(R=0.477,P< 0.001)。這些數(shù)據(jù)顯示，血清miR-219-5p、 miR-19b-1和miR-25作為獨立危險因素提示OS的肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生(圖3)。

圖3 Logistic回歸分析預(yù)測OS肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生

注：A:OS患者血清miR-219-5p與OS肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析；B:OS患者血清miR-19b-1與OS肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析；C:OS患者血清miR-151-3p與OS肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析；D:OS患者血清miR-32與OS肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析；E:OS患者血清miR-363與OS肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析；F:OS患者血清miR-25與OS肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析

3 討論

OS患者死亡的主要原因是骨癌細(xì)胞發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，因而較為迫切的需要良好的非侵入性生物學(xué)指標(biāo)來實時監(jiān)測并提示OS轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險，從而改善OS患者的臨床護(hù)理和治療效能。miRNA可以在患者的各種體液中被檢測出來，如外周血、腦脊液和淋巴液。由于循環(huán)系統(tǒng)和各器官組織的物質(zhì)交換，可以間接反映病灶的分子生化改變，且具有侵入性小等優(yōu)點，使得外周血成為極為優(yōu)秀的生物檢材[15]。外周血中的miRNA可以穩(wěn)定結(jié)合在蛋白或者包被于外囊泡中，可作為潛在的生物標(biāo)記物來增加各種疾病的診斷性能[16]。

本研究中，報道了6例被確診了的OS患者和已經(jīng)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的OS患者外周血中miRNA的表達(dá)性差異，試圖尋找與OS肺轉(zhuǎn)移發(fā)生的關(guān)鍵miRNA分子。miRNA微矩陣芯片結(jié)果顯示，在95個預(yù)檢測的miRNA中，有47個miRNA發(fā)生了明顯上調(diào)或下調(diào)，表明這些miRNA在OS肺轉(zhuǎn)移過程中存在可能的調(diào)控作用。已有研究[17]利用預(yù)選miRNAs微矩陣序列芯片，將OS外周血miRNA用作OS診斷或預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，如篩選與OS發(fā)病相關(guān)的miRNA，包括miR-21、 miR-199a-3p、 miR-107、miR-335和miR-374a-5p在OS患者的血清中明顯上調(diào)，具有潛在的OS診斷潛能。在術(shù)后患者的血清miRNA中，有4個miRNAs (miR-195-5p、miR-199a-3p、miR-320a和 miR-374a-5p)明顯上調(diào)，且與預(yù)后成正比，表明這些miRNA可作為OS術(shù)后判斷預(yù)后的指標(biāo)[18]。然而，還很少有研究觀察OS肺轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移OS患者外周血中的miRNA差異表達(dá)。

本研究對在miRNA芯片中高度差異的6個miRNA進(jìn)行qPCR檢測，包括明顯上調(diào)的miR-219-5p、miR-19b-1及miR-151-3p以及明顯下調(diào)miR-32、 miR-363和miR-25。相對于41例OS未轉(zhuǎn)移的患者，35例發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的OS患者外周血中miR-219-5p、miR-19b-1及miR-151-3p均明顯上調(diào)，而miR-32、miR-363和miR-25則明顯下調(diào)。這些差異性表達(dá)的miRNA可能直接參與OS肺轉(zhuǎn)移的病理進(jìn)程。Logistic模型常被用于生物學(xué)指標(biāo)對疾病診斷性能的預(yù)測[19]。雖然這6個miRNA均表現(xiàn)出明顯差異，然而只有miR-219-5p、miR-19b-1和miR-25(P<0.05)可以有效區(qū)分OS患者和OS肺轉(zhuǎn)移患者，即在OS患者外周中檢測到上調(diào)的miR-219-5p和miR-19b-1或下調(diào)的miR-25具有較差的肺轉(zhuǎn)移預(yù)后。這些研究提示在初次診斷OS患者時，要對血清miR-219-5p、miR-19b-1上調(diào)或miR-25下調(diào)的OS患者格外關(guān)注，因其具有極大的肺轉(zhuǎn)移風(fēng)險(或可能已經(jīng)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移)。

綜上所述，本研究篩選和驗證了OS患者血清miR-219-5p、miR-19b-1和miR-25可以作為潛在的非侵入性生物標(biāo)志物，以監(jiān)測OS的發(fā)生和肺轉(zhuǎn)移。然而，這些差異miRNA分子在OS肺轉(zhuǎn)移所扮演的角色還需要進(jìn)一步研究。