HBV相關肝纖維化中Klotho蛋白的表達及臨床意義*

聶 芳，黃 蝶，黃琪蕓，許 穎Δ

1.成都醫學院第一附屬醫院 檢驗科 (成都 610500)；2.成都醫學院 檢驗醫學院(成都 610500)

肝纖維化是乙型肝炎病毒(HBV)引起的慢性乙肝發展成肝硬化的中間過程，是多種肝病所共有的組織學改變，炎癥是慢性肝病的基本病變，所有肝臟損傷修復都必然經歷炎癥、肝纖維化這一過程。肝纖維化是由各種致病因素所致的肝內細胞外基質(ECM) 包括膠原、非膠原糖蛋白、蛋白多糖過度沉積的病理過程，是一系列損傷因子作用后引起的一種可逆性性損傷后修復的過程[1]。肝纖維化以及肝硬化早期在通過適當的臨床干預后其實能夠逆轉，早期發現確診并進行有效的治療以阻斷肝纖維化的發生和發展，使其降解、逆轉，對預防肝硬化具有重要意義。

Klotho是新近發現的一種抗衰老基因，其表達產物分為膜結合型和分泌型兩種蛋白。在許多抗衰老研究中也已經證實分泌型Klotho蛋白還能夠抑制細胞和組織的氧化應激，抑制凋亡。Klotho抑制了CsA誘發的EMT和腎纖維化，發現CsA可以降低Klotho表達，促進腎的纖維化，并激活EMT反應，表現為TGF-β1的增加和α-SMA的表達，E-cadherin表達的減少；Klotho能通過調節腎臟內EMT相關蛋白的表達，明顯改善腎臟的病理病變[2]。然而，目前關于Klotho基因與肝纖維化的相關作用機制和臨床應用幾乎處于空白。本實驗從人體血清學水平研究分泌型Klotho在HBV導致肝臟纖維化中的表達及臨床意義，闡述Klotho表達水平與乙型肝炎病情嚴重程度的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

分別收集2017年2月至2018年2月成都醫學院第一附屬醫院健康體檢、收治入院或門診就診的符合條件的5組入選人群共319例，其中正常組77例、慢性乙型肝炎組(分為輕、中、重度3組，分別為59例、51例、64例)、肝硬化組68例。所有入選者統一入選標準：年齡在30～88歲，性別不限，排除合并糖尿病、高血壓、肝癌、甲狀腺疾病、心血管疾病、除HBV外其他病毒感染引起的急慢性肝炎，以及其他原因導致的肝硬化(自身免疫性肝炎、酒精性肝硬化、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、遺傳代謝性或藥物性肝炎)等。其中健康體檢者作為正常組，除統一入選標準外，既往均無乙型肝炎病史或新近發現乙型肝炎；輕度乙肝組入選標準：既往有乙型肝炎病史或新近發現乙型肝炎，6個月內未經抗病毒治療，HBV DNA小于1 000 IU/mL，ALT在正常值范圍內，影像學檢查(B超、CT)未見肝臟纖維化改變；中度乙肝組入選標準：既往有乙型肝炎病史或新近發現乙型肝炎，6個月內未經抗病毒治療，HBV DNA>1 000 IU/mL，ALT在正常值范圍內，影像學檢查(B超、CT)未見肝臟纖維化改變；重度乙肝組入選標準：既往有乙型肝炎病史或新近發現乙型肝炎，6個月內未經抗病毒治療，HBV DNA>1 000 IU/mL，6個月內至少2次ALT超過正常值上限的2倍，影像學檢查(B超、CT)可見肝臟纖維化改變；肝硬化組均為經肝組織活檢所診斷，入選標準：既往有乙型肝炎病史，6個月內未經抗病毒治療，HBV DNA>1 000 IU/mL，6個月內影像學檢查和肝組織活檢均診斷為肝硬化。

在進行實驗前均取得所有入選者的知情同意，同時通過成都醫學院醫學倫理委員會(人體實驗)倫理審查。留取所有受試者的血液樣品，檢測相關指標后凍存在-80 ℃冰箱以備后續檢測。

1.2 研究方法

在本院檢驗科抽靜脈血6 mL于紅色采血管中,離心15 min獲得血清，然后將血清分為3份，1份用于檢測生化相關指標，1份用于檢測肝纖4項中的HA(透明質酸)濃度，最后1份凍存在-80 ℃冰箱用于后續檢測Klotho蛋白濃度。采用日立全自動生化分析儀7600檢測各組血清中肝功能生化指標：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、谷氨酰轉移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、膽汁酸(TBA)的濃度；采用熒光定量PCR儀檢測血清HBV DNA水平；采用安圖公司Autobio A2000plus 全自動化學發光測定儀分析系統檢測各組血清中透明質酸(HA)的濃度；采用人Klotho ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，CSB-E13235h)檢測各組血清中Klotho蛋白的濃度，操作嚴格按照說明書進行。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組肝功能生化指標在各組中的比較

5組在性別、年齡一般資料方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)。生化指標結果顯示：5組血清中總蛋白(TP)含量，差異無統計學意義(P>0.05)；與正常組相比較，ALT表達量在重度乙肝組中更高(P<0.05)，ALB表達量在中度乙肝組、重度乙肝組和肝硬化組中更低(P<0.05)，AST、GGT、ALP、TBIL、DBIL、TBA表達量在重度乙肝組和肝硬化組中更高，PA表達量在輕度、中度、重度乙肝組和肝硬化組中均較低，差異具有統計學意義(P<0.05)(表1)

表1 各組肝功能生化指標含量的比較

注：與正常組相比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 Klotho與肝纖維化指標HA在各組中的表達差異

輕度、中度、重度乙肝組和肝硬化組患者血清中Klotho蛋白表達水平均高于正常組，差異具有統計學意義(F=35.770，P<0.001)；重度乙肝組和肝硬化組患者血清中Klotho蛋白表達水平均高于正常組，差異具有統計學意義(F=40.450，P<0.001)(表2、圖1)。

表2 Klotho與肝纖維化指標HA在各組中的表達差異

注：與正常組相比較,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖1 Klotho與肝纖維化指標HA在各組中的表達差異

注：A：5組患者血清中Klotho蛋白表達水平比較，與正常組相比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；B： 5組患者血清中HA蛋白表達水平比較，與正常組相比較，**P<0.01，***P<0.001

2.3 Klotho與各項肝功能指標的相關性

Klotho與AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA均成正相關(P<0.05)，與ALB、PA成負相關(P<0.05)，與ALT、GGT、TP均無相關性(P>0.05)(表3)。

2.4 Klotho與肝纖維化指標HA的相關性

Klotho和HA蛋白濃度經過Log Transform處理后進行相關性分析，結果表明在乙型肝炎和肝硬化患者中Klotho和HA成明顯的正相關(r=0.782,P<0.05)(圖2)。

項目Log(Klotho)rPLog(HA)0.7820.001

圖2 Klotho與肝纖維化指標HA的相關性分析

3 討論

在當今社會肝纖維化是一個預后極差且病死率很高的疾病，嚴重威脅著人類的健康，常見于多數慢性肝臟疾病中[3]。在發達國家，導致肝臟纖維化的主要原因包括慢性丙型肝炎病毒感染、酗酒和非酒精性脂肪性肝病等。而在發展中國家中，慢性乙型肝炎病毒感染、酗酒是導致肝纖維化的主要因素[4]。因此，肝纖維化也是各種慢性肝臟疾病發展至肝硬化的關鍵，作為進一步發展肝硬化及肝癌的中間過程，也是肝臟炎癥、肝臟腫瘤等許多慢性肝臟疾病的重要中間環節，對探索肝癌等其他疾病的發生有重要的意義。以往研究者[5]認為肝纖維化是不可逆的，但是近年來臨床上越來越多的實際病例表明，肝纖維化這種疾病在經過治療后，可能會繼續發展，也可能會逆轉。重視肝纖維化的及早治療，從而使“慢性肝炎-肝纖維化-肝硬化-肝癌”這條慢性進展過程得以終止。

目前臨床上用病理肝穿、B超、CT、MRI、實驗室診斷等診斷肝纖維化，血清學指標的高低與肝穿診斷的肝纖維化嚴重程度密切相關，不如肝穿刺檢查來得直接，但對于某一病人來說，往往很難根據一次化驗指標高低來確定肝纖維化的程度。血清化驗的優點是取材方便、容易復查，如果能定期檢查(如每半年或一年)則可以根據這些指標是升高或降低的總趨勢來了解肝臟纖維化的發展變化情況，也可大致了解抗纖維化治療的臨床效果。目前肝纖維化和肝硬化無創診斷的血清學模型參數主要是肝纖維化四項血清指標PCIII(III型前膠原)、IV-C(IV型膠原)、LN(層粘連蛋白)、HA(透明質酸酶)，尤其是HA，對判斷肝纖維化有較好的相關性，臨床診斷價值較高[6]。

Klotho是一種新發現的抗衰老基因，最初人們發現，該基因缺陷小鼠會出現一系列類似人類衰老的表型變化，包括生長阻滯、動脈硬化、骨質疏松、代謝功能紊亂等[7]，其表達產物有膜結合型和分泌型兩種蛋白，二者分別是膜結合受體和體液調節因子，能通過如調節維生素D和鈣、磷代謝，抗凋亡、保護心血管系統等途徑，抗衰老等多種疾病進行調節。分泌型Klotho蛋白在體內可作為一種內分泌激素，能夠在血液、尿液、腦脊液中檢測到。有研究[8]顯示，Klotho蛋白在腎癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中表達水平較低，尤其在腎癌組織中的表達量與腫瘤大小、臨床分期成負相關，與病人的生存率成正相關，說明Klotho蛋白可能是一個腫瘤抑制因子，其能抑制腫瘤細胞增殖。Camilli等[9]在對黑色素細胞瘤的研究中發現，Klotho基因表達的上調能夠抑制鈣蛋白酶，減少細絲蛋白A的裂解，進而改變細胞骨架，能夠促進細胞間葉標志物神經鈣黏蛋白的下調，并使在細胞間起粘連調節作用的上皮鈣黏蛋白表達的上調，促進EMT相關基因表達的下調，在逆轉EMT方面發揮重要作用。現今EMT過程在纖維化的發生發展過程中的作用越來越受到重視，EMT可能是肝纖維化另外一條重要機制。因此，本課題旨在研究Klotho在乙肝肝硬化中的表達差異，以及其含量與HA的相關性。

本研究顯示，319例臨床病例中重度乙肝組和肝硬化組血清HA蛋白均高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。而Klotho在輕、中度乙肝組的表達差異具有統計學意義(P<0.05)，在重度慢性HBV相關性肝病尤其是乙肝肝硬化中較正常組表達明顯更高。肝纖維化是重度乙型肝炎發展為肝硬化的重要病理過程，這些結果表明Klotho可能成為肝纖維化中一個更為敏感的檢測指標，并且提示Klotho可能參與了肝纖維化的病理發病機制。

另外，我們發現Klotho與肝功能指標AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA均成正相關，與ALB、PA成負相關，與ALT、GGT、TP均無相關性，這些結果表明Klotho與肝功能炎癥損害密切相關，但是Klotho與肝臟炎癥活動的重要指標ALT無相關性，其可能解釋是ALT易受降酶藥物等諸多因素的影響，且部分肝炎患者在肝臟炎癥活動時ALT卻不出現明顯異常，部分肝硬化患者或肝細胞嚴重壞死者其ALT水平與肝臟炎癥或損傷程度也不成平行關系。

Klotho與肝纖指標HA水平呈正相關性預示著它們可能在肝纖維化中發揮著相同的作用機制。HA的主要作用是參加構成蛋白聚糖多聚體，能夠被內皮細胞攝取和降解。如果肝細胞遭到刺激而受傷，處于沉睡狀態下的肝星狀細胞(HSC)就會轉變為活化狀態，HA合成和排泌上調，再加上內皮細胞數量相對減少，功能降低致透明質酸降解減少，從而致使透明質酸間接增多[10]。相關研究[11]表明在慢性肝病的發展中，HA在急性肝炎、慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化中濃度由低到高。血清HA對肝纖維化的病情改變比其它血清學指標更敏感，是目前反映肝纖維化和肝炎癥的所有血清學指標中最敏感的指標，Klotho與HA 的正相關關系預示Klotho可以作為肝纖維化診斷模型一個獨立或附加參數，聯合肝纖四項形成新的預測模型，使慢性乙型肝炎肝纖維化診斷模型更準確更多樣化，對預防肝硬化，指導早期干預具有重要意義。

綜上所述，Klotho蛋白可能參與了肝功能炎癥損害和肝纖維化的發生發展，為探討Klotho對肝纖維化的抗炎作用，以及抑制肝纖維化的上皮間充質轉化的作用，還需要在后續的動物和細胞實驗進一步探究具體的作用機制及分子機制。相關研究在完善肝纖維化的分子調控機制方面具有重要意義。