磷酸川芎嗪不同給藥方式在大鼠體內藥代動力學的研究

吳婷婷，楊科偉，余 婷，陳 麟，杜朝樹，蘇 青

成都醫學院 藥學院(成都 610000)

川芎嗪化學名為四甲基吡嗪，是從傳統中藥川芎中提取分離出來的生物堿[1]。研究[2-3]表明，川芎嗪具有抗血栓、抑制血小板聚集、保護心腦血管系統、抗腫瘤等藥理作用。磷酸川芎嗪(tetramethylpyrazinephosphate，TMPP)是川芎嗪的衍生物之一，是一種新型的鈣通道阻滯劑，臨床上主要用于治療心腦血管、呼吸系統等疾病[4-5]。目前，TMPP 用于臨床主要為片劑及注射劑。研究[6-7]表明，口服TMPP首過效應明顯，生物半衰期短，生物利用度低。因此，臨床應用需要頻繁給藥以維持有效血藥濃度，長期用藥十分不便，并且易造成體內藥物蓄積，增加毒副作用。此外，TMPP注射劑刺激性較大，患者順應性較差，將TMPP開發成控釋劑型可有效避免上述局限性。查閱相關資料[8]發現，川芎嗪游離堿分子量小(136.20)，熔點低(76～78 ℃)，油水分配系數適中，適合經皮給藥。目前，有報道[9-10]研制TMPP透皮制劑，但透皮給藥系統不盡相同。凝膠膏劑載藥量大，與皮膚相容性好，采用親水性高分子材料提高了藥物的經皮滲透。基于兩者優勢，前期將TMPP開發成凝膠膏劑，制備得到的TMPP凝膠膏劑各項性能均符合藥劑學要求。本研究對TMPP凝膠膏劑、片劑以及注射劑在大鼠體內的藥動學進行研究，為TMPP凝膠膏劑進一步研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

磷酸川芎嗪原料藥(南京澤朗生物科技有限公司，批號DZ20170418)；磷酸川芎嗪對照品(成都食品藥品檢驗研究院，批號100845-201002)；磷酸川芎嗪片(北京燕京藥業有限公司，批號160402)；磷酸川芎嗪注射劑(自制，批號20180110)；磷酸川芎嗪凝膠膏劑(自制，批號20171208)；香豆素(成都市科龍化工試劑廠，色譜純)；肝素鈉(成都市科龍化工試劑廠，分析純)；甲醇為色譜純，乙腈、冰醋酸為分析純；水為純化水。

1.2 實驗儀器

Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，Sartorius BP211D電子天平(德國賽多利斯公司)，XK80-A快速混勻器(江蘇新康醫療器械有限公司)，Heraeus Pico 17離心機(ThermoFisher)，UPH-1-20T優譜超純水器(成都超純科技有限公司)，pHS-4C+智能型酸度計(成都世紀方舟科技有限公司)，KH3200E超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)。

1.3 實驗動物

18只SD大鼠，隨機分為凝膠膏劑組、口服給藥組及靜脈注射組，每組各6只，雌雄兼有，體重250～300 g，四川省人民醫院動物研究所提供，動物合格證號：SCXK(川)2013-15。

1.4 方法

1.4.1 TMPP凝膠膏劑及注射劑的制備 精密稱取卡波姆5.000 g，TMPP原料藥2.172 g，加入100 g純化水充分攪拌，浸泡過夜，作為A相。精密稱取EDTA-2Na 0.037 g、甘羥鋁 0.055 g、聚丙烯酸鈉3.560 g，加入19.300 g甘油中，攪拌均勻，充分溶脹，作為B相。精密稱取酒石酸0.054 g、PVP 1.980 g，加入12.600 g純化水中，充分溶解，作為C相。將B相分次加入A相混合攪勻，作為D相，再將C相少量多次加入D相攪勻成黏稠狀半固態流體后，涂布于面積為5 cm×5 cm的無紡布上，放置成型，加蓋聚乙烯薄膜，即得TMPP凝膠膏劑。精密稱取TMPP適量，用注射用水溶解成濃度為6 mg/mL的溶液，用10%氫氧化鈉溶液調pH至2.0～3.0，經0.22 μm微孔濾膜過濾至澄明，灌裝，封口，115 ℃熱壓蒸汽滅菌30 min，即得TMPP注射劑。

1.4.2 血漿樣品中TMPP測定方法建立 1)色譜條件：色譜柱：welchrom-C18( 250 mm×4.6 mm，5 μm) ；流動相：甲醇-水(體積分數為35∶65) ，冰醋酸調pH至(3.7±0.05)；流速1.0 mL/min；檢測波長293 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 L。2)內標溶液配制：精密稱取香豆素適量，用甲醇溶解制得20 μg/mL的內標溶液。3)血漿樣品處理方法：精密吸取200 μL空白血漿樣品，加入內標溶液20 μL，渦旋混勻5 min，加入300 μL乙腈，渦旋混勻5 min，12 000 r/min，離心半徑7 cm，高速離心10 min后，取上清液，待用。4)血漿標準曲線：精密稱取TMPP對照品適量，加甲醇配成濃度為1 mg/mL的標準溶液，用流動相稀釋成一系列濃度的標準溶液。加入血漿200 μL，再分別加入各標準溶液配成濃度為0.1、0.2、0.4、1、2、4、8、10、20、40、60、80、120、150 μg/mL的血漿溶液。按3)項下操作，并按照HPLC測定方法進行測定，以樣品峰面積與內標峰面積的比值對樣品濃度作線性回歸，得到標準曲線方程。5)方法專屬性：在本實驗條件下，分別將空白血漿、TMPP對照品及樣品血漿注入液相色譜儀進行測定，記錄保留時間及色譜圖。6)精密度、準確度試驗：按4)項下方法配制低、中、高3種不同濃度TMPP(0.2、10、120 μg/mL)血漿樣品溶液各5份，于1 d內與連續3 d處理并測定，計算日內和日間精密度及回收率。7)提取回收率：分別配制低、中、高3種不同濃度TMPP(0.2、10、120 μg/mL)血漿樣品溶液各5份，按照血漿樣品預處理方法和HPLC測定方法進行測定，記錄平均峰面積；同時配制同等濃度TMPP標準溶液各5份進行測定，記錄平均峰面積。計算兩者峰面積比值。8)穩定性：分別配制低、中、高3種不同濃度TMPP(0.2、10、120 μg/mL)血漿樣品溶液各3份，分別考察血漿樣品在室溫下放置24 h、4 ℃下放置2 d、-20 ℃下反復凍融3次以及在-40 ℃下放置7 d的穩定性。

1.4.3 體內藥動學實驗 1)貼劑給藥及血樣采集 SD大鼠6只，雌雄各半，實驗前1 d以刀片于背部脫毛，確保皮膚完好，用生理鹽水洗凈，待用。單次給予TMPP凝膠膏劑1貼，緊密貼于大鼠背部裸露皮膚，用醫用膠帶加以固定。于給藥前和給藥后0、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、15、24(除去貼劑)、36、48 h尾靜脈取血約500 μL，置于預先用肝素潤洗過的離心管中，5 000 r/min，離心半徑7 cm，離心10 min，取上清血漿200 μL。按1.4.2中3)項下方法進行血漿樣品處理，采用HPLC內標法測定血漿中TMPP濃度。2)口服給藥及血樣采集 SD大鼠6只，雌雄各半，實驗前禁食12 h，自由飲水，單次灌胃TMPP片劑，給藥劑量為31.25 mg/kg，于給藥前及給藥后0、0.083、0.167、0.250、0.333、0.667、1、1.5、2、4 h尾靜脈取血約500 μL，置于預先用肝素潤洗過的離心管中，5 000 r/min，離心半徑7 cm，離心10 min，取血漿200 μL。按1.4.2中3) 項下方法進行血漿樣品處理，采用HPLC內標法測定血漿中TMPP濃度。3)注射給藥及血樣采集 SD大鼠6只，雌雄各半，尾靜脈注射TMPP注射液，劑量為10 mg/kg[11]，分別于給藥后0.083、0.167、0.333、0.5、1、1.5、2、3、4、6 h尾靜脈取血約500 μL，置于預先用肝素潤洗過的離心管中，5 000 r/min，離心半徑7 cm，離心10 min，取血漿200 μL。按1.4.2中3)項下方法進行血漿樣品處理，采用HPLC內標法測定血漿中TMPP濃度。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 血藥濃度測定方法的建立

2.1.1 標準曲線 血漿標準曲線方程為：Y=0.265 6X-0.052 (R2=0.999 9)，表明血漿中TMPP的濃度在0.1～150 μg/mL線性關系良好。

2.1.2 方法專屬性 TMPP保留時間約為16.503 min，內標物保留時間約為18.520 min，主藥與內標能較好分離，血漿內源性成分不干擾樣品的測定，說明此方法測定血漿中TMPP的專屬性較高，最小檢測濃度為0.1 μg/mL (S / N ≥3 )(圖1)。

圖1 高效液相色譜圖注：A：空白血漿；B：TMPP對照品；C： 血漿樣品；1：TMPP；2：內標(香豆素)

2.1.3 精密度、準確度 測得日內RSD分別為4.41%、3.88%、3.04%，日間RSD分別為5.92%、4.68%、3.26%(表1)。

表1 TMPP在大鼠血漿中的精密度和準確度

2.1.4 提取回收率 血漿中TMPP平均提取回收率分別為82.94%，102.57%，87.71%，RSD分別為1.04%，3.08%，7.08%。表明該方法準確可靠。

2.1.5 穩定性 TMPP在各貯存條件下穩定性良好，結果如下(表2)。

2.2 血藥濃度-時間曲線

TMPP 3種不同劑型在大鼠體內藥時曲線如下(圖2)。由此可看出，大鼠在給予TMPP片劑和注射劑后，吸收和消除迅速，凝膠膏劑吸收消除則較為緩慢，血藥濃度波動小，作用時間延長。

圖2 大鼠給予3種TMPP制劑后的平均血藥濃度-時間曲線

2.3 藥動學參數

TMPP凝膠膏劑組的t1/2是口服給藥組的8.6倍，是靜脈注射組的4.1倍。TMPP凝膠膏劑的達峰時間較片劑明顯延長，AUC0-t是片劑的1.4倍，是注射劑的2.6倍，MRT0-t是片劑的4.8倍，是注射劑的8.9倍。TMPP凝膠膏劑主要藥動學參數與片劑及注射劑相比差異有統計學意義(P<0.05)，說明凝膠膏劑給藥較片劑及注射劑有明顯優勢(表3～4)。

表3 TMPP凝膠膏劑與片劑藥動學參數

注：與凝膠膏劑相比，*P<0.05

表4 TMPP凝膠膏劑與注射劑藥動學參數

注：與凝膠膏劑相比，*P<0.05

3 討論

本研究建立了大鼠血漿中TMPP的HPLC分析方法，專屬性高。內標法排除血漿中內源性物質的干擾，方法精密度、回收率良好，符合藥動學研究要求。

目前，國內外均沒有TMPP凝膠膏劑的上市產品，因此采用上市片劑及注射劑為參比制劑，考察凝膠膏劑與片劑及注射劑在大鼠體內藥動學差異。TMPP凝膠膏劑的吸收較片劑緩慢而持久，表觀消除速率較片劑及注射劑小，主要藥動學參數(t1/2、AUC0-∞、MRT0-∞)差異有統計學意義(P<0.05)。TMPP凝膠膏劑能維持較為平穩及持續的血藥濃度，具有明顯的緩釋作用，能夠避免片劑帶來的血藥濃度波動，說明TMPP經皮給藥是可行的。

使藥物在較短的時間內達到有效血藥濃度并維持恒定釋放是經皮制劑研究的重點[12]。本研究中，TMPP凝膠膏劑能平穩持續釋放藥物，但其在大鼠體內的Cmax較口服片劑小，究其原因可能是由于給藥劑量過小，因此，如何選擇合適的給藥劑量還需要深入考察，以確保凝膠膏劑能夠在較短時間內達到有效治療血藥濃度，同時能夠保證在安全劑量范圍內。

實驗過程中，貼劑在24 h后移除，繼續采集36、48 h的血漿樣品，測定結果均在最低定量限以下。由于沒有采集24 ～36 h的血樣，因此看不出在移除貼劑后血藥濃度是否有明顯下降。透皮制劑基質處方以及制備工藝不盡相同，因此，本研究開發的TMPP凝膠膏劑在大鼠皮膚內有無蓄積還需要進一步考察。