姜黃素對口腔鱗狀細胞癌Tca8113細胞增殖及凋亡的影響

馮儒學，蔡仁剛，解丹丹

1.海南省干部療養院(海南省老年病醫院) 口腔科 (海口 571100)；2.文昌市人民醫院 口腔科 (文昌 571300)；3.海南醫學院第一附屬醫院 營養科(海口 570102)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是最常見的口腔惡性腫瘤之一，在頭頸癌中約占90%，在所有惡性腫瘤中占2%～4%，是導致頭頸部癌癥發病和死亡的主要因素[1-2]。OSCC是一種發生于口腔黏膜，以惡性程度高，易發生局部侵襲及頸部淋巴結轉移，患者生存率低為特點的鱗狀細胞癌。有研究[3]顯示，OSCC是世界第八大癌癥，5年存活率<60%，嚴重威脅人類的生命健康。近年來，OSCC雖然在治療方法上取得了很大進展，但其發病率和病死率并未得到顯著改善，且呈年輕化趨勢。因此，尋找和發現具有抗口腔鱗狀細胞癌的治療藥物具有十分重要的意義。

姜黃素是姜黃的主要活性成分，主要從姜黃的根莖中提取，在中國和印度作為中草藥被廣泛應用。近年來，姜黃素作為一種很有前景的新型天然化學物質，在化學預防和癌癥化療中得到了廣泛的研究，這些研究[4-5]結果表明，姜黃素是一個高效、低毒的藥物，可作用于多個分子靶點，選擇性殺死具有低內在毒性的腫瘤細胞。大量研究證實，姜黃素對腫瘤細胞具有抑制作用，體外實驗[6-8]結果顯示，姜黃素對胃腺癌(SGC7901細胞)、前列腺癌(PC-M3細胞)、鼻咽癌(NCE細胞)、結腸癌(SW480細胞)及肺癌(A549細胞)等均有明顯的抑制作用。動物體內實驗[9]結果顯示，姜黃素對S180細胞等移植瘤抑制率較高。進一步研究[10]發現，姜黃素可通過上調Bcl-2以及激活PI3K/AKT信號通路抑制喉癌細胞的增殖和促進凋亡。目前，關于姜黃素對口腔鱗狀細胞癌的作用報道較少，因此本研究觀察了姜黃素作用OSCC Tca8113細胞后，對其增殖和凋亡、凋亡相關蛋白及PI3K/AKT信號通路表達量的影響，并進一步研究了PI3K抑制劑LY294002、姜黃素單獨及聯合作用OSCC細胞后，PI3K/AKT信號通路蛋白表達量的變化，旨在探究姜黃素對OSCC細胞的抑制作用及其可能的作用機制。

1.1 材料與方法

1.1 實驗材料

細胞株、藥物及主要試劑：人OSCC Tca8113細胞購自美國ATCC公司；姜黃素購自美國Sigma公司；LY294002購自美國Selleck公司；胰島素樣生長因子-1(IGF-1)購自北京博奧森生物技術有限公司；胎牛血清、Trizol總RNA抽提試劑盒及RPMI1640培養液購自美國GIBCO公司；逆轉錄試劑盒購自大連Takara公司；單克隆抗體及辣根過氧化物標記的二抗購自北京博奧森生物技術有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人OSCC Tca8113細胞置于含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL的RPMI1640培養基中，于37 ℃、5%CO2的恒溫細胞培養箱中培養。選取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞增殖檢測 將對數生長期的Tca8113細胞制成1×104/mL的細胞懸液，以每孔100 μL接種至96孔培養板中進行培養，待細胞貼壁后，分別加入濃度為0、25、50、100 μmol/L的姜黃素及50 μmol/L順鉑各100 μL，每個藥物濃度設6個重復孔。0 μmol/L姜黃素組作為空白對照組，順鉑組作為陽性對照組。分別孵育培養24、48 h后，每孔加入濃度為5 g/L的MTT(20 μL)，避光孵育4 h后，棄上清，每孔加入DMSO(150 μL)，震蕩至紫色絮狀物完全溶解(約10 min)，于490 nm處用酶標儀檢測吸光度(OD)值。

1.2.3 細胞凋亡檢測 各處理組細胞培養48 h后，收集各組細胞制成細胞懸液， 500 r/min，離心5 min，離心半徑10 cm，用磷酸緩沖液(PBS)清洗2次后加入binding buffer (500 μL)，再分別加入Annexin V-FITC和Propidium lodide各5 μL混勻，避光室溫孵育20 min，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 Western blot法檢測細胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平 細胞培養及處理同1.3.2，培養48 h后，進行PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達的檢測。收集培養后的細胞，使用細胞裂解液(RIPA)進行裂解，12 000 r/min，離心15 min，離心半徑13.5 cm，收集上清液，使用BCA試劑盒測定蛋白含量。根據蛋白濃度檢測結果，取25 μL 總蛋白進行 Western blot 檢測。利用 5% 的脫脂奶粉封閉液封閉 2 h，一抗 4 ℃ 孵育過夜，二抗孵育 1 h，利用 tanon 5200 全自動化學發光 /熒光圖像分析系統檢驗蛋白圖像，計算蛋白相對表達量(目的蛋白灰度/β-actin灰度)。

1.2.5 QRT-PCR檢測細胞PI3K、Akt和p-Akt mRNA表達水平 根據試劑盒操作步驟，采用Trizol法提取細胞總RNA，并使用反轉錄試劑盒進行cDNA合成。以cDNA模板進行PCR擴增，所用引物如表1所示。利用Mx3005P熒光定量PCR儀進行熒光定量檢測。以 β-actin為內參，以 2-△△Ct 表示mRNA 的相對表達量(表1)。

表1 PCR擴增引物序列

1.2.6 姜黃素、LY294002及IGF-1對Tca8113細胞增殖及凋亡的影響 將對數生長期的Tca8113細胞制成1×104/mL的細胞懸液，以每孔100 μL接種至96孔培養板中進行培養，待細胞貼壁后，分別加入DMSO、姜黃素(100 μmol/L)、LY294002 (20 μmol/L)、IGF-1 (100 μg/L)、姜黃素+IGF-1各100 μL，每個藥物濃度設6個重復孔。DMSO組作為空白對照組。分別孵育培養24、48 h后，分別采用MTT及流失細胞術檢測細胞增殖及凋亡情況，具體操作如1.2.2和1.2.3。

1.2.7 姜黃素、LY294002及IGF-1對Tca8113細胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白和mRNA表達水平的影響 細胞處理及培養同1.2.6，培養48 h后，進行PI3K、Akt和p-Akt蛋白和mRNA表達的檢測。分別采用Western blot和RT-PCR檢測蛋白和mRNA的表達情況，具體操作如1.2.4和1.2.5。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 姜黃素對Tca8113細胞增殖的影響

姜黃素對Tca8113細胞有明顯的活性抑制作用，且呈濃度、時間依賴性，與對照組相比差異具有統計學意義(P>0.05)。25和50 μmol/L姜黃素組與順鉑組相比細胞活性增加，差異具有統計學意義(P<0.05)，而100 μmol/L姜黃素組與順鉑組相比差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 姜黃素對Tca8113細胞增殖的影響

注：與對照組相比,*P<0.05；與順鉑組相比,#P<0.05

2.2 姜黃素對Tca8113細胞凋亡的影響

姜黃素組細胞凋亡率明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。與順鉑組相比，25和50 μmol/L姜黃素組細胞凋亡率明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，而100 μmol/L姜黃素組與順鉑組相比差異無統計學意義(P>0.05)(圖1、表3)。

圖1 姜黃素對Tca8113細胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白和mRNA表達水平的影響

注：A：蛋白表達水平；B：mRNA表達水平。1:對照組；2:25 μmol/L姜黃素組；3:50 μmol/L姜黃素組；4:100 μmol/L姜黃素組；5:順鉑組。與對照組相比，*P<0.05；與順鉑組相比，#P<0.05

表3 不同姜黃素濃度對Tca8133細胞凋亡率的影響

注：與對照組相比，*P<0.05；與順鉑組相比，#P<0.05

2.3 姜黃素對Tca8113細胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白和mRNA表達水平的影響。

姜黃素組PI3K、p-Akt和mTOR蛋白和mRNA表達水平明顯低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；同時，25和50 μmol/L姜黃素組PI3K、p-Akt和mTOR蛋白和mRNA表達水平高于順鉑組，差異具有統計學意義(P<0.05)，而100 μmol/L姜黃素組與順鉑組相比差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。

圖2姜黃素、LY294002及IGF-1對Tca8113細胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白和mRNA表達水平的影響

注：A：蛋白表達水平；B：mRNA表達水平。1:對照組；2:IGF-1組；3:IGF-1+姜黃素組；4:100 μmol/L姜黃素組；5:組LY294002組。與對照組相比，*P<0.05；與IGF-1組相比，#P<0.05

2.4 姜黃素、LY294002及IGF-1對Tca8113細胞增殖的影響

IGF-1組細胞活性明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；且姜黃素組、姜黃素+IGF-1組及LY294002組細胞活性明顯低于對照組和IGF-1組，差異具有統計學意義(P<0.05)。姜黃素組與LY-294002組相比差異無統計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 姜黃素、LY294002及IGF-1對Tca8113細胞增殖的影響

注：與對照組相比,*P<0.05；與IGF-1組相比,#P<0.05

2.5 姜黃素、LY294002及IGF-1對Tca8113細胞的凋亡影響

IGF-1組細胞凋亡率明顯低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；且姜黃素組、姜黃素+IGF-1組及LY294002組凋亡率明顯高于對照組和IGF-1組，差異具有統計學意義(P<0.05)。姜黃素組與LY-294002組相比差異無統計學意義(P>0.05)(表5)。

表5 姜黃素、LY294002及IGF-1對Tca8133細胞凋亡率的影響

注：與對照組相比,*P<0.05；與IGF-1組相比,#P<0.05

2.6 姜黃素、LY294002及IGF-1對Tca8113細胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白和mRNA表達水平的影響

IGF-1組PI3K、Akt和m-TOR蛋白和mRNA表達水平明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；且姜黃素組、姜黃素+IGF-1組及LY294002組PI3K、Akt和m-TOR蛋白和mRNA表達水平明顯低于IGF-1組和對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。姜黃素組與LY294002組相比，差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。

3 討論

OSCC是一種具有不同分化程度、侵襲性強、預后差的腫瘤，煙草和酒精的慢性刺激、慢性炎癥、普魯默-文森綜合征、病毒感染及遺傳傾向等均是該病的發病因素[11]。近年來，針對OSCC的發生發展分子機制、治療及預后恢復，進行了大量的研究，研究發現，控制腫瘤惡化的關鍵分子和開發新型治療方法比阻斷或抑制侵襲和/或轉移對于治療和改善OSCC的預后更重要。

姜黃素主要由類姜黃素(70%)、雙去氧基姜黃素(10%～20%)和去甲氧基姜黃素(10%)組成，具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗突變、抗腫瘤和抗抑郁等多種藥理活性[12-15]。目前，關于姜黃素對細胞因子、激酶、轉錄因子、生長因子和受體的作用進行了大量的研究，結果顯示其具有抗微生物、抗炎、抗氧化、免疫調節、腎臟保護、保肝、抗癌等作用。進一步的體內和體外研究發現，姜黃素主要通過影響腫瘤促進、血管生成和腫瘤生長三個過程抑制癌癥的發生[16-17]。姜黃素能夠抑制包括人非小細胞肺癌BEAS-2E細胞[18]、喉癌AMC-HN-8細胞[10]、卵巢癌SKOV3細胞[19]、胃癌細胞SGC-701細胞[20]在內的多種癌細胞的體外增殖，但姜黃素對OSCC Tca8113的抑制作用報道較少。本研究結果顯示，姜黃素能夠有效抑制OSCC細胞的增殖、促進細胞凋亡，并具有濃度與時間依賴性，這與之前姜黃素在其他腫瘤細胞研究中所得的結果一致。

PI3K家族是一類廣泛存在于細胞中的特異性催化磷脂酰肌醇物質的激酶，可通過Akt/mTOR細胞內信號通路參與細胞存活、遷移、增殖和分化、血管生成、蛋白質合成和葡萄糖代謝等多種生理過程，此外，該途徑被認為與許多致癌過程密切相關[21]。 PI3K / AKT / mTOR是癌癥中失調最頻繁的信號傳導途徑之一[22]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K途徑的中心介質，AKT的激活進一步磷酸化調節多種細胞反應(包括細胞凋亡、代謝、細胞增殖和細胞生長)的多種蛋白質，激活的AKT通過激活mTOR復合物(mTORC)1促進蛋白質合成和細胞生長。磷酸化的mTORC1激活p70 S6激酶，其增強信使RNA翻譯并通過激活核糖體蛋白S6和延伸因子2驅動細胞生長[23]。近年的研究[24-26]發現，PI3K/AKT/mTOR信號通路在胃癌、結直腸癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食管鱗狀細胞癌等多種腫瘤組織中過表達和活化。大量研究證實，抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的表達可抑制腫瘤細胞的增殖、誘導凋亡。Pontes等[27]研究發現，口腔鱗狀細胞癌組織中p-AKT在細胞膜和細胞質均有表達，且隨著惡性程度加深表達水平顯著升高，提示AKT的活化可能與OSCC的發生、發展有關。本研究結果顯示，不同濃度姜黃素作用OSCC Tca8113細胞能夠降低PI3K、AKT、mTOR的表達水平，且作用效果呈時間、濃度依賴性，說明姜黃素可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制口腔鱗狀細胞癌的增殖并誘導凋亡。

為進一步證實姜黃素通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路進而抑制OSCC Tca8113細胞增殖和誘導凋亡的作用，本研究進一步探究了姜黃素、PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002和激動劑胰島素樣生長因子-1(insulin like growth factor, IGF-1)單獨及聯合應用對OSCC細胞抑制增殖、誘導凋亡及PI3K、AKT、mTOR表達的影響。研究結果顯示，姜黃素、LY294002及姜黃素與IGF-1聯合應用對OSCC Tca8113細胞有顯著的抑制作用，IGF-1對OSCC Tca8113細胞有顯著的促進增殖作用和抑制凋亡作用，同時姜黃素可減緩IGF-1引起的促進增殖作用和抑制凋亡作用，上述結果說明姜黃素是通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路進而抑制OSCC Tca8113細胞增殖和誘導凋亡。

綜上所述，姜黃素能夠誘導OSCC Tca8113細胞的增殖并促進細胞凋亡，其機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的表達有關。本研究提示，姜黃素可能對OSCC的發生發展具有抑制作用，這為姜黃素抗腫瘤的臨床應用提供理論基礎及實驗依據。