糖尿病大鼠前額葉部位淀粉樣蛋白水平與自噬水平變化的關系研究*

馬樓艷，李 洺，翟佳佳，呂雅麗，成蕊寧

西安市第九醫院 老年病二科(西安 710054)

全球糖尿病患者人數迅猛增長，已成為中國重要的民生健康問題。糖尿病對其他疾病的影響也日益受到重視。目前，糖尿病已被視為阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD )的獨立危險因素[1]，故明確糖尿病促進AD發病的機制，有利于早期預防AD的發生發展。前期研究[2]發現，STZ誘導的糖尿病大鼠海馬部位存在自噬的激活，但是自噬流不通，溶酶體功能出現異常，最終導致Aβ清除障礙，海馬神經元凋亡增加。前額葉和海馬均是大腦參與學習與記憶的重要部位，既往研究[3]發現，糖尿病大鼠前額葉部位存在Aβ蛋白沉積，但糖尿病大鼠前額葉部位自噬水平的情況目前鮮有報道。本實驗采用STZ誘導的糖尿病大鼠模型，研究糖尿病大鼠成模第8、10、12周時的認知功能，前額葉神經元的超微結構以及前額葉部位Aβ和自噬指標的表達情況，探討糖尿病促進認知障礙發生的機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

鏈脲佐菌素(STZ),Morris水迷宮及水迷宮記錄分析系統(中國醫學科學院藥物研究所研制)，兔抗Aβ大鼠多克隆抗體(Abcame)，兔抗大鼠Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62抗體，Trizol(TAKARA)，Real-time PCR擴增反應體系(TAKARA)，引物設計及合成(上海生工生物工程有限公司合成)(表1)。

表1 各引物序列

1.2 方法

1.2.1 動物 SPF級SD雄性大鼠90只，8～10周齡，體重180～200 g(西安交通大學動物實驗中心)。動物適應性喂養1周后，采用隨機數字表法將其隨機分為正常組(n=45)和糖尿病組(n=45)。建立經典的STZ誘導的糖尿病大鼠模型：所有大鼠禁食12 h后，糖尿病組大鼠腹腔注射1%的STZ(65 mg/kg)，正常對照組腹腔注射等劑量生理鹽水，3 d后測大鼠尾靜脈空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L，提示模型建立成功。

1.2.2 Morris水迷宮測試 分別于成模后第7、9、11周，訓練3 d，第4天進行隱藏平臺獲得實驗，分析潛伏期，考察學習能力。第5天撤去平臺進行空間搜索實驗，去除平臺觀察2 min內大鼠穿越中心區域的次數，測試記憶能力。

1.2.3 電鏡觀察 水迷宮測試結束后，每組取出5只大鼠，深度麻醉大鼠，采用心臟灌流的方法，留取大鼠前額葉標本，固定。標本制作良好后，在電鏡下觀察不同時期各組大鼠前額葉神經元的超微結構。

1.2.4 qRT-PCR 抽提前額葉組織的總RNA，按照PrimeScirpt RT Master Mix試劑盒說明書進行，將RNA逆轉錄為cDNA ；進一步按照SYBR? Premix Ex TaqTMII 試劑盒說明書建立實時熒光定量PCR的反應體系。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40 個循環，每個循環進行實時熒光檢測，最末循環作熔鏈曲線分析。實驗引物委托上海生工生物科技有限公司設計合成(表1)。

1.2.5 Western blot 提取前額葉組織總蛋白，將動物組織放置于1.5 mL的EP管中，進行裂解，用BCA法測定蛋白濃度，完成配置凝膠，上樣，電泳，染色，轉膜，封閉，分別孵育一抗、二抗，發光，顯影，攝像等過程。進行條帶灰度值分析及統計分析。

1.2.6 免疫組化 采用SP法免疫組織化學染色，處死大鼠，1%甲醛心臟灌注取腦，石蠟包埋連續切片，根據試劑盒說明檢測Aβ、Beclin-1、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ在大鼠前額葉部位的表達。具體步驟如下：常規石蠟切片脫蠟，高壓鍋煮沸修復抗原，3%過氧化氫滅活內源性酶，正常山羊血清封閉，滴加一抗過夜，37 ℃孵育1 h，加入山羊抗兔IgG、SP復合物，DAB顯色，鏡下控制反應時間，以陽性產物是棕黃色為度。蘇木素復染，脫水透明，中性樹脂封片，顯微鏡觀察照相。每個標本隨機選取3張切片，每張切片高倍鏡下隨機選取3個視野，采用ImageJ 6.0軟件測定該區域Aβ、Beclin-1、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ陽性染色神經元的平均吸光度值，取其平均吸光度值作為結果。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 Morris水迷宮測試結果

2.1.1 隱藏平臺獲得實驗 與正常組大鼠比較，糖尿病組大鼠自第8周開始，出現逃避潛伏期增加(P<0.05)，且隨著時間的延長，第10周和第12周糖尿病大鼠逃避潛伏期較正常對照組均延長(P<0.001)(表2)。

2.1.2 空間搜索實驗 與正常組大鼠相比，自第8周始糖尿病組大鼠穿越目標區域次數明顯下降(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠在成模第8、10、12周時Morris水迷宮成績

2.2 電鏡結果

4 000倍電鏡下可見糖尿病組大鼠前額葉神經元細胞間隙增寬，細胞水腫明顯。40 000倍電鏡下可見神經細胞結構紊亂，線粒體腫脹，內質網等細胞器結構模糊不清，核質固縮碎裂(圖1)。

圖1 電鏡觀察各組大鼠前額葉部位超微結構

注：A：正常組大鼠第8周時前額葉神經元的超微結構(×4 000)；B：糖尿病組大鼠第8周時前額葉神經元的超微結構(×4 000)；C：糖尿病組大鼠第10周時前額葉神經元的超微結構(×4 000)；D：糖尿病組大鼠第12周時前額葉神經元的超微結構(×4 000)；E：正常組大鼠第8周時前額葉神經元的超微結構(×40 000)；F：糖尿病組大鼠第8周時前額葉神經元的超微結構(×40 000)；G：糖尿病組大鼠第10周時前額葉神經元的超微結構(×40 000)；H：糖尿病組大鼠第12周時前額葉神經元的超微結構(×40 000)

2.3 qRT-PCR檢測結果

與正常組大鼠對比，第8周糖尿病組大鼠前額葉部位Aβ前體(amyloid precursor protein，APP)mRNA表達升高(P=0.037),Beclin-1 mRNA表達水平升高(P=0.008)。LC3Ⅰ mRNA在第8周和第10周時與正常組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，到第12周時表達水平明顯下降(P=0.001)。LC3ⅡmRNA第8周時與正常組相比，表達水平升高(P=0.028)，在第10周和第12周時表達水平均升高(P=0.011和P=0.019)(圖2～3)。

圖2Westernblot、免疫組化及qRT-PCR檢測大鼠前額葉神經元Aβ、APPmRNA表達情況

注：A：qRT-PCR檢測各組大鼠前額葉APP mRNA的表達；B： Western blot檢測各組大鼠前額葉Aβ水平灰度值；C：免疫組化檢測各組大鼠前額葉Aβ水平的光密度值。與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與糖尿病組第8周比較，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001

圖3 Western blot、免疫組化及qRT-PCR檢測各組大鼠前額葉神經元相關蛋白、mRNA表達情況

注：A：各組大鼠前額葉部位Beclin-1 mRNA表達情況；B： Western blot檢測各組大鼠前額葉部位Beclin-1灰度值; C：免疫組化檢測各組大鼠前額葉部位Beclin-1的光密度值；D：各組大鼠前額葉部位LC3Ⅰ mRNA表達情況; E：各組大鼠前額葉部位LC3ⅡmRNA表達情況；F：Western blot檢測各組大鼠前額葉部位LC3Ⅱ/ Ⅰ灰度值比值；G：免疫組化檢測各組大鼠前額葉部位LC3Ⅱ/Ⅰ的光密度值比值；H：Western blot檢測各組大鼠前額葉部位p62灰度值。與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；與糖尿病組第8周比較，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001

2.4 Western blot結果

與正常組大鼠相比，糖尿病組大鼠第8周時Aβ蛋白表達明顯升高(P=0.005)，第10周時Aβ蛋白表達較正常組升高(P=0.021)，且高于第8周時糖尿病組的水平(P=0.035)，第12周時Aβ蛋白表達升高明顯(P=0.011)，同樣也高于第8周時糖尿病大鼠的表達水平(P=0.008)。且隨著時間延長，Aβ蛋白表達逐漸升高(r2=0.961,P<0.001)。第8周時糖尿病大鼠前額葉部位Beclin-1蛋白表達升高(P=0.035)，第10周時Beclin-1蛋白表達同樣升高(P=0.005)，第12周時Beclin-1蛋白表達與正常組相比升高更為明顯(P<0.001)。LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白灰度值比較結果顯示，第8周時糖尿病組大鼠前額葉部位LC3 Ⅱ/Ⅰ比值較正常組升高(P=0.005)，到第10周時LC3 Ⅱ/Ⅰ比值較正常組升高(P=0.003)，且高于第8周時LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達(P=0.008)，第12周時糖尿病組大鼠LC3 Ⅱ/Ⅰ比值明顯高于正常組大鼠(P<0.001)，且明顯高于第8周時糖尿病組的水平(P<0.001)。兩組大鼠前額葉部位p62蛋白水平在第8、10、12周時表達差異無統計學意義(P>0.05)(圖3～4)。

圖4Westernblot檢測各組大鼠前額葉神經元相關蛋白的表達情況

2.5 免疫組化結果

2.5.1 Aβ陽性細胞表達 與正常組大鼠相比，糖尿病大鼠前額葉部位自第8周始可見大量的Aβ陽性細胞，光密度值明顯高于正常組(P=0.008)，第10周時前額葉部位Aβ陽性細胞的光密度值高于正常組(P=0.004)，且同樣高于第8周時Aβ表達(P=0.005)。第12周時糖尿病組Aβ陽性細胞的光密度值明顯高于正常組(P=0.003)，也高于第8周時糖尿病組Aβ的表達(P<0.001)。且隨著糖尿病病程延長，Aβ陽性細胞數目明顯增加(r2=0.960，P<0.001)(圖2、圖5)。

圖5 免疫組化檢測各組大鼠前額葉神經元Aβ的表達情況(×200)

注：A：正常組；B：糖尿病組第8周；C：糖尿病組第10周；D：糖尿病組第12周

2.5.2 Beclin-1陽性細胞表達 第8周時與正常組大鼠相比，糖尿病大鼠前額葉部位可見大量的Beclin-1陽性細胞，光密度值明顯高于正常組(P=0.005)；第10周時前額葉部位Beclin-1陽性細胞的光密度值高于正常組(P=0.003)，且同樣高于第8周時Beclin-1的表達(P=0.004)。第12周時糖尿病組Beclin-1陽性細胞的光密度值明顯高于正常組(P<0.001)，也高于第8周時糖尿病組Beclin-1的表達(P<0.001)(圖3、圖6)。

圖6免疫組化檢測各組大鼠前額葉神經元Beclin-1的表達情況(×200)

注：A：正常組；B：糖尿病組第8周；C：糖尿病組第10周；D：糖尿病組第12周

2.5.3 LC3Ⅰ陽性細胞的表達 與正常組大鼠相比，糖尿病大鼠前額葉部位在第8、10、12周時可見LC3Ⅰ陽性細胞數量減少(圖7)。

圖7免疫組化檢測各組大鼠前額葉神經元LC3Ⅰ的表達情況(×200)

注：A：正常組；B：糖尿病組第8周；C：糖尿病組第10周；D：糖尿病組第12周

2.5.4 LC3Ⅱ陽性細胞的表達 與正常組大鼠相比，第8、10、12周時糖尿病大鼠前額葉部位可見大量的LC3Ⅱ陽性細胞(圖8)。LC3Ⅱ和LC3Ⅰ蛋白光密度值的比值顯示：第8周時，糖尿病大鼠前額葉部位LC3Ⅱ/Ⅰ比值高于正常組(P=0.005)，第10周時同樣高于正常組(P=0.027)，但較第8周時LC3Ⅱ/Ⅰ比值差異無統計學意義(P=0.078；第12周時糖尿病組大鼠前額葉部位LC3Ⅱ/Ⅰ光密度比值高于正常組(P=0.031)，同樣高于第8周時糖尿病組LC3Ⅱ/Ⅰ光密度比值(P=0.041)(圖3)。

圖8免疫組化檢測各組大鼠前額葉神經元LC3Ⅱ的表達情況(×200)

注：A：正常組；B：糖尿病組第8周；C：糖尿病組第10周；D：糖尿病組第12周

2.5.5 Aβ表達水平與自噬相關蛋白表達的相關性Western blot檢測蛋白灰度值的結果顯示，糖尿病組大鼠前額葉部位Aβ表達與Beclin-1表達呈正相關(r2=0.671 0,P<0.01)；免疫組化結果顯示，Aβ表達與Beclin-1表達呈正相關(r2=0.955 8,P<0.001)；Western blot檢測蛋白灰度值的結果顯示，Aβ表達與LC3Ⅱ/Ⅰ的比值呈正相關(r2=0.799 2,P<0.01)；免疫組化結果顯示，Aβ表達與LC3Ⅱ/Ⅰ的比值表達呈正相關(r2=0.889 1,P<0.001)(圖9)。

圖9糖尿病組大鼠前額葉部位Aβ與自噬相關蛋白表達的相關性

注：A：Western blot結果中糖尿病大鼠前額葉部位Aβ與LC3Ⅱ/ Ⅰ灰度值的相關性；B：Western blot結果中糖尿病大鼠前額葉部位Aβ與Beclin-1灰度值的相關性；C：免疫組化結果中糖尿病大鼠前額葉部位Aβ與Beclin-1光密度值的相關性；D：免疫組化結果中糖尿病大鼠前額葉部位Aβ與LC3Ⅱ/ Ⅰ光密度值的相關性

3 討論

自噬是指從粗面內質網的無核糖體附著區脫落的雙層膜包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分，形成自噬體或自噬液泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新，完成對包裹物質的降解和循環再利用。自噬在細胞清除廢物、結構重建、生長發育中起重要作用。自噬抑制后導致變性蛋白和失能細胞器等清除延遲以及異常蓄積，從而誘發相應的病理過程[4-5]。AD患者腦內存在Aβ的過度聚集，最近研究[6]顯示，自噬是降解和清除異常聚集蛋白的主要機制。國外眾多學者研究[7]發現，STZ誘導的糖尿病大鼠成模第8周時即出現認知功能下降，而且糖尿病大鼠成模第14周后的死亡率增加，故選取在成模第8、10、12周作為檢測糖尿病大鼠的行為學和相關指標的時間點。本研究發現，STZ誘導的糖尿病大鼠在成模第8周時Morris水迷宮測試結果可見潛伏期延長，穿越目標區域次數減少，表現出空間學習能力下降，提示糖尿病大鼠出現明顯認知功能障礙，這與國外研究結果一致。Aβ不能清除或者降解時，在腦內聚集并纖維化，進一步形成老年斑，這是AD發病的中心環節和重要病理學基礎。前期研究[3]發現，STZ誘導的糖尿病大鼠海馬及前額葉神經元部位Aβ蛋白沉積，合并認知障礙。本研究發現，前額葉神經元可見Aβ沉積，同時伴有自噬相關蛋白Beclin-1表達增加，LC3Ⅱ/Ⅰ比值升高，提示自噬激活。通常情況下，自噬水平激活，p62水平下降，清除異常聚集蛋白能力增加。但在本研究中，p62表達水平不變，同時Aβ沉積未改善，且Aβ表達與自噬相關蛋白的表達呈正相關性，提示可能自噬體包裹Aβ蛋白后，自噬流不通，導致Aβ清除障礙，大量Aβ沉積，進一步加重神經系統的損害，導致認知功能障礙。自噬體包裹異常蛋白后，會與溶酶體融合進一步消化分解，故推測自噬流不通的原因可能與溶酶體功能異常相關，導致蛋白聚集后的清除障礙。這需要進一步研究前額葉部位的溶酶體功能來明確，也是下一步研究重點。