L-蘋果酸和檸檬酸聯合對異育銀鯽生長性能、抗氧化能力、血液和血清生化相關指標的影響

■程 義 張 蕾 郭曦堯 尚信池 王 楠 劉 佳 張一琳 李月紅

(吉林農業大學動物科學技術學院教育部動物生產及產品質量安全重點實驗室，吉林長春 130118)

提高健康和效益是水產養殖的一個重要目標，而飼料中添加添加劑是其中重要的手段之一。飼料添加劑是提高飼料性能和動物性能的非營養性成分。有機酸及其鹽類具有提高飼料利用率、動物生長性能及抗病性的作用，是潛在的添加劑而被廣泛研究。這些有機酸包括蟻酸、丙酸、乙酸、丁酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸和山梨酸及其鹽類被應用于水產養殖業[1]。有機酸及其鹽類參與人體的代謝途徑，使ATP在羧酸循環中產生能量，提高某些營養素的消化率[2]。其中檸檬酸（CA）和L-蘋果酸（MA）作為三羧酸循環（TCA）中重要組成部分而被人們所熟知。檸檬酸可以影響多種魚類的生長以及消化酶活性。冷向軍等[3]研究表明，基礎飼料中添加0.2%檸檬酸顯著促進異育銀鯽幼魚的生長。黎軍勝等[4]研究表明，添加10 g/kg檸檬酸可以極顯著提高異育銀鯽胃蛋白酶、肝胰臟和腸道淀粉酶活性，同時極顯著降低腸道蛋白酶活性。L-蘋果酸同樣可以影響魚類消化酶的活性。李贊[5]研究表明，飼料中添加L-蘋果酸可以提高羅非魚胃蛋白酶和肝臟檸檬酸合酶活性及肝臟ATP含量。單獨探究檸檬酸或L-蘋果酸對魚類生長、血液血清相關指標影響的研究較多，但二者聯合對魚類影響的研究較少，本試驗旨在探究不同添加量的L-蘋果酸和檸檬酸對異育銀鯽的生長性能、抗氧化能力和血液及血清學相關指標的影響，進一步深入探究酸化劑的作用機制，為異育銀鯽飼料生產中合理添加L-蘋果酸和檸檬酸提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 化學試劑

L-蘋果酸（MA，Sigma公司）、檸檬酸（CA，國藥集團化學試劑有限公司）純度均＞99%，并且試劑均為分析純（AR級），過氧化氫酶（CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司。

1.2 試驗分組

試驗魚為240尾異育銀鯽，由長春市新立城水庫提供。飼養水體為充分曝氣的自來水，水溫維持在(25±2)℃，pH值為6.9～7.4，溶氧5～7 mg/l，氨氮含量為0.4～0.5 mg/l，每缸水體體積為80 L，保持水泵24 h供氧。馴養兩周后，選取健康、規格均勻的鯽魚進行隨機分組：空白對照Ⅰ組和試驗Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組。試驗在總結前人基礎上，異育銀鯽日糧中檸檬酸的最佳添加量為0.2%。這5個組中Ⅰ組飼喂基礎飼料，其他組基礎飼料中分別添加0.2%CA（Ⅱ組）、0.2%CA+0.1%MA（Ⅲ組）、0.2%CA+0.2%MA（Ⅳ組）、0.2%CA+0.4%MA（Ⅴ組），試驗周期為60 d。每組3個重復，每個重復16尾魚，總共15個水缸。每天飼喂2次（8:00和18：00），投喂量為魚平均體重的3%～4%。試驗期間每兩天換一次水，換水量約為70%。

1.3 基礎日糧、試驗飼料及營養水平

按照NRC魚類營養需要設計基礎飼料配方，基礎日糧組成和營養水平（風干基礎）見表1。將5種飼料所有成分分別與適當的水完全混合，并通過實驗室造粒機擠出成直徑為2.0 mm的顆粒。制粒溫度為(80±5)℃，50 ℃烘干(含水量17%)，并在4℃冰箱保存。

表1 基礎日糧組成和營養水平(風干基礎)

1.4 樣品處理與采集

飼養試驗結束，鯽魚停喂24 h，稱量魚體體重。使用1 ml無菌注射器對每組鯽魚進行尾椎靜脈取血，并分裝到無菌促凝管和抗凝管中，4℃保存。魚體組織樣品在冰盤上解剖采集，無菌生理鹽水清洗后用濾紙吸干置于無菌10 ml EP管中，-80℃保存備用。

1.5 血液及血清生化指標的測定

使用BayerDVIA 120型血細胞分析儀測定白細胞總數(WBC)、紅細胞總數（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞壓積（HCT）、紅細胞平均體積(MCV)、平均血紅蛋白濃度(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板(PLT)指標。使用貝克曼（ProCX4）全自動生化分析儀測定谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、尿素氮（UREA）、肌酐（CREA）、血糖（GLU）、乳酸脫氫酶（LDH）、堿性磷酸酶（AKP）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）指標。檢測地點為吉林省疾病預防控制中心。

1.6 組織中抗氧化酶的測定

將保存的肝胰臟組織樣品準確稱量后，按質量（g）∶體積（ml）=1∶9比例加入9倍體積的生理鹽水，使用組織勻漿機在冰水浴條件下制備勻漿，2 500～3 000 r/min離心10 min，最后吸取上清備用。SOD、CAT活性測定的具體操作均按南京建成生物工程公司試劑盒說明書進行。

1.7 數據處理及分析

增重率(%)=（Wt-W0）/W0×100

特定生長率(%/d)=（lnWt-lnW0）/t×100

式中：Wt、W0——分別表示終末均重、初始均重(g)；

t——表示養殖時間(d)。

存活率(%)=存活尾數/總尾數×100

數據使用IBM SPSS Statistics 20.0軟件單因素分析法Tukey進行統計分析，試驗統計結果采用“平均值±標準差”表示，顯著水平P＜0.05。

2 結果

2.1 檸檬酸和L-蘋果酸對異育銀鯽生長性能的影響(見表2)

表2 異育銀鯽存活率、增重率及特定生長率

由表2可知，與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ組異育銀鯽增重率和特定生長率顯著升高（P＜0.05），最高值均出現在第Ⅳ組。與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽增重率和特定生長率顯著升高（P＜0.05）；所有組存活率均為100%。

2.2 異育銀鯽血液生理指標測定結果(見表3)

表3 異育銀鯽血液生理指標測定值

由表3可知，相比Ⅱ組，Ⅲ、Ⅳ組異育銀鯽RBC、HGB指標顯著升高（P＜0.05），Ⅳ組WBC指數顯著升高（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組MCH 均顯著升高（P＜0.05），HCT、MCV、MCHC、PLT各組差異均不顯著（P＞0.05）。相比于Ⅰ組，各試驗組PLT均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 異育銀鯽血清生化指標測定結果(見表4)

表4 異育銀鯽血清生化指標測定值

表4（續） 異育銀鯽血清生化指標測定值

由表4可知，與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽ALT、AST活性均顯著升高（P＜0.05），Ⅳ、Ⅴ組LDH活性均顯著升高（P＜0.05），Ⅳ組AKP活性顯著升高（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ組 ALB、TP濃度均顯著升高（P＜0.05），AKP、ALB、TP最高值均出現在Ⅳ組。與Ⅰ組相比，所有試驗組LDH活性、ALB濃度顯著升高（P＜0.05）。各組間UREA、CREA、GLU含量差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 異育銀鯽肝胰臟CAT和SOD活性測定結果(見圖1)

圖1 肝胰臟CAT（左）及SOD（右）活性

由圖1可知，與Ⅱ組相比，Ⅲ組SOD活性顯著提高（P＜0.05），Ⅳ、Ⅴ組CAT、SOD活性顯著降低（P＜0.05）；與Ⅰ組相比，Ⅱ、Ⅲ組SOD、CAT活性均顯著提高（P＜0.05），Ⅳ組SOD活性顯著升高（P＜0.05），Ⅴ組CAT和SOD活性均顯著降低（P＜0.05）；SOD和CAT活性最高值均出現在第Ⅲ組。

3 討論

3.1 對生長性能的影響

飼料中添加有機酸可有效改善飼料利用率，水生動物的生長性能，但有機酸的作用具有高度種屬特異性。Dai等[6]通過在飼料中添加檸檬酸研究其對幼年大菱鲆生長性能的影響，結果表明，添加3%檸檬酸可以提高低磷飼料中P的利用率，而對生長性能沒有影響。與此相反，Castillo等[7]研究表明，飼料中添加1.5%檸檬酸可以顯著提高美國紅魚幼魚生長性能以及提高胃蛋白酶、胰酶（胰蛋白酶、脂肪酶）和腸道酶（亮氨酸氨肽酶、磷酸酶）的活性。Arshad等[8]通過在飼料中添加有機酸研究其對紅海鯛生長和磷利用的影響，結果表明，與喂食不含無機磷飼料組相比，飼喂1%檸檬酸的紅海鯛體重增加，有機磷利用率提高，飼喂1%蘋果酸對紅海鯛體重和有機磷利用率無顯著影響。李贊[5]研究表明，飼料中添加L-蘋果酸可以提高羅非魚腸道消化酶和肝臟檸檬酸合酶活性及肝臟ATP含量。本試驗中，酸化劑組異育銀鯽增重率和特定生長率均顯著高于空白對照組；與只添加0.2%CA組相比，額外添加MA為0.1%或0.2%時，增重率和特定生長率均顯著提高，額外添加0.4%MA增重率和特定生長率差異不顯著，這可能由于少量L-蘋果酸可以配合檸檬酸與飼料礦物質反應以及適當降低飼料中的pH值，有助于胃蛋白酶消化飼料，而高濃度L-蘋果酸配合檸檬酸可能對消化酶活性具有負面作用。

3.2 對血液生理指標的影響

血液生物化學被廣泛用于魚類研究，反映了魚類的一般健康狀況[9]。Kartik等[10]研究發現，使用含有3%檸檬酸飼料飼喂南亞野鯪幼魚后，血紅蛋白（HGB）和紅細胞壓積（HCT）顯著提高，但對紅細胞數量（RBC）無影響。白細胞是先天免疫反應中的關鍵組成部分，調節免疫功能和魚的抗病能力[11]。本試驗中，與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ組RBC、HGB均顯著升高，Ⅳ組WBC數量顯著升高，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組MCH顯著升高，HCT、MCV、MCHC、PLT各組差異不顯著；與Ⅰ組相比，所有試驗組異育銀鯽WBC、RBC、HGB指標均高于空白對照組，而血小板濃度（PLT）指標均低于空白對照組；這些指標變化表明添加適宜濃度有機酸可以提高血液運輸氧氣功能，WBC的變化表明檸檬酸和蘋果酸可能影響異育銀鯽的免疫功能，PLT顯著降低表明檸檬酸和L-蘋果酸可能引發血小板減少癥。

3.3 對血清生化指標的影響

血清學指標可以從側面反映魚類體內新陳代謝狀況。AST和ALT是重要的氨基轉移酶，參與氨基酸代謝。在魚類營養研究中，血清AST和ALT有時被用作評估肝臟整體健康狀況的指標，并以較低濃度存在于血漿中，當它們活性增加時，表明組織出現病變，尤其是肝胰臟[12-13]。本試驗中，相比Ⅰ、Ⅱ組，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽血清AST和ALT活性隨著L-蘋果酸濃度增大而上升，表明高濃度的L-蘋果酸損傷異育銀鯽肝臟功能。血清中UREA和CREA水平是評估腎臟整體健康狀況的重要標志物[9]，UREA水平變化反映了動物體內蛋白質的代謝情況，而CREA水平上升大多數見于腎小球濾過功能的減退。本試驗各個組間UREA、CREA差異均不顯著，表明通過攝入的方式，L-蘋果酸可能對異育銀鯽腎臟功能無顯著影響。LDH是一種糖酵解酶，參與能量代謝，幾乎分布于機體所有組織細胞胞質內，當機體組織細胞受到病變或損傷時，LDH被釋放到血液中。本試驗中，試驗組異育銀鯽LDH活性顯著高于空白對照Ⅰ組；相比于Ⅱ組，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽LDH活性隨著L-蘋果酸濃度增大而上升，其中Ⅳ、Ⅴ組LDH活性顯著提升，表明高濃度L-蘋果酸誘導異育銀鯽肝臟損傷，LDH被大量釋放到血清中。AKP廣泛參與動物機體內核酸、蛋白、生物堿等物質去磷酸化過程，同時也是機體解毒體系的一部分。本試驗中，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽AKP活性均顯著高于空白對照組；相比于Ⅱ組，Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽LDH活性隨著L-蘋果酸濃度增大而顯著上升，表明高濃度蘋果酸可能引起異育銀鯽肝胰臟損傷，機體內AKP含量上升，緩解機體損傷。TP水平主要反映肝臟合成功能，而ALB是TP的一種，主要起到維持膠體滲透壓、運輸營養物質和有毒物質的功能。本試驗中，隨著L-蘋果酸濃度提高，各試驗組TP和ALB含量表現出先升高再降低趨勢，但均高于空白對照組，這可能由于高濃度檸檬酸和L-蘋果酸作為能量物質以及毒性物質，促進TP和ALB的合成，從而緩解機體和肝臟損傷。

3.4 對肝胰臟抗氧化酶活性指標的影響

氧化應激反應會釋放活性氧自由基（ROS），而過量ROS會積累于肝臟中造成核酸損傷、蛋白質氧化、脂質過氧化[14]。抗氧化酶是機體防御氧化應激的重要體系，其中SOD、CAT作為抗氧化防御因子，通過催化ROS發生歧化反應或將機體內過氧化氫還原成水，來實現抗氧化防御減少機體損傷[15]。敬婷等[16]研究發現，飼料中隨著L-蘋果酸添加量的升高，湘云鯽肝臟SOD、蘋果酸脫氫酶（MDH）活性呈現先升高后下降的趨勢，最高值均出現在4 g/kg添加組，而丙二醛（MDA）含量則相反。這與本試驗部分結果相似，與Ⅱ組相比，隨著L-蘋果酸濃度增高，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組異育銀鯽SOD、CAT活性均出現先上升后下降的趨勢；與空白對照Ⅰ組相比，Ⅴ組CAT、SOD活性顯著降低；SOD、CAT活性最高值均出現在第Ⅲ組；結果表示，由于檸檬酸和L-蘋果酸可以通過三羧酸循環相互轉換，適宜濃度L-蘋果酸可能促使異育銀鯽機體產生反饋抵抗機制以應對應激反應，隨著酸濃度升高，抗氧化酶活性受到抑制，因而對機體造成了氧化損傷。

4 結論

飼料中適量添加檸檬酸+L-蘋果酸可以顯著提高異育銀鯽的增重率、特定生長率和抗氧化能力，但過量可能引起肝損傷，血小板降低癥。