蛋白質精氨酸甲基轉移酶5參與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的相關性研究

徐衛(wèi)東, 顧 曉

(1. 揚州大學, 江蘇 揚州, 225000; 2.南京鼓樓醫(yī)院集團儀征醫(yī)院, 江蘇 儀征, 2214003. 揚州大學 臨床醫(yī)學院, 江蘇 揚州, 225000)

膀胱癌是全球范圍內泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1-4]。膀胱癌早期癥狀不明顯，且早期的診斷技術特異性和靈敏性欠佳，患者診斷膀胱癌時多已是中晚期[5-8]。目前，膀胱癌的復發(fā)率和轉移率還是較高，加強膀胱癌發(fā)病風險及其分子機制研究，對早期發(fā)現(xiàn)以及后期個體化治療有著深遠的意義[9-13]。蛋白質精氨酸甲基轉移酶(PRMTs)在蛋白質的甲基化中起著十分重要的作用[14-16]。PRMTs在真菌、高等植物以及無脊椎和脊椎動物中都有著廣泛的表達，能夠將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉移到底物蛋白胍基上，從而影響RNA轉錄、RNA剪接、DNA修復、細胞周期、細胞增殖凋亡等多種細胞生物學過程[17-20]?，F(xiàn)在已經發(fā)現(xiàn)的PRMTs家族成員有11個，根據(jù)催化精氨酸甲基化方式的不同，可將其主要分為以下3種類型[21]: ① Ⅰ型PRMT家族成員，包括PRMT 1～4、PRMT6、PRMT8, 其可以催化形成單甲基精氨酸(MMA)和非對稱二甲基精氨酸(ADMA); ② Ⅱ型PRMT家族成員，包括PRMT5、PRMT9, 可以催化形成MMA 和對稱性二甲基精氨酸(SDMA); ③ PRMT7是唯一的Ⅲ型PRMT, 只能催化形成MMA。PRMT5是一種非常重要的II型PRMT, 在所有研究的真核生物中都發(fā)現(xiàn)了它的存在，其作為一種表觀遺傳酶，能夠對稱性地甲基化組蛋白或者非組蛋白底物的精氨酸殘基，影響靶基因的表達或者信號分子的翻譯后修飾，調節(jié)多種細胞過程，發(fā)揮著不同生物學功能[17-18, 22-23]。大量研究[24-30]表明, PRMT5在多種腫瘤中顯著高表達，如在乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、惡性膠質瘤、卵巢癌、黑色素瘤、結直腸癌以及白血病等疾病中表達水平都較正常人群增高，發(fā)揮著癌基因作用。

大量證據(jù)表明PRMT5可能是臨床腫瘤篩查的重要標志物。本研究檢測PRMT5在膀胱尿路上皮癌中的表達情況，探討其在膀胱尿路上皮癌發(fā)生、發(fā)展及預后中的意義。通過癌癥基因組圖譜(TCGA)公共數(shù)據(jù)集，在RNA水平研究PRMT5在膀胱癌及正常組織中的表達水平及其對預后生存的影響，在此基礎上再通過組織芯片進行免疫組化實驗，在蛋白水平驗證上述結果，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 癌癥和腫瘤基因圖譜數(shù)據(jù)庫

TCGA是美國政府2005年發(fā)起資助的癌癥研究項目，是目前最大的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫，目前主要由美國國家癌癥研究所(NCI)和國家人類基因組研究所(NHGRI)共同維護。TCGA通過大規(guī)模的高通量的基因組測序及生物信息學分析，系統(tǒng)地匯總并揭示疾病的遺傳突變信息，了解癌細胞發(fā)生、發(fā)展的機制，為疾病的預防、診斷以及治療提供了理論基礎，最后勾畫出新型“預防癌癥的策略”。TCGA數(shù)據(jù)庫中的每個樣本包含多種基因組學信息，有基因表達譜數(shù)據(jù)、基因分型數(shù)據(jù)、全基因組DNA甲基化表達數(shù)據(jù)以及microRNA表達數(shù)據(jù)等。本研究下載了TCGA數(shù)據(jù)庫中的349例膀胱癌患者的基因表達譜及相關的臨床信息進行后續(xù)研究。

1.2 實驗樣本

1.2.1 樣本收集: 收集2007-2011年南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院以及江蘇省中醫(yī)院接受手術治療的56例膀胱癌病例，在簽署知情同意書后，采集其癌組織和癌旁組織。所有患者術前未接受化療，有完整的臨床資料及術后回訪資料。所有標本均在手術切除后10 min內收集, 4%中性福爾馬林固定，經石蠟包埋和組織切片進行免疫組織化學染色。所有病例是組織病理學確診的膀胱癌患者。

1.2.2 流行病學調查: 對調查人員進行統(tǒng)一培訓，并且設計好統(tǒng)一的調查表，然后采用面對面的方式調查研究對象。調查內容主要包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、臨床分期、病理分級、腫瘤大小以及有無淋巴結轉移等。自2014年3月對調查對象進行跟蹤隨訪。所有結果使用EpiData 3.1進行雙軌錄入，并進行邏輯校對。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織芯片: 將HE染色切片進行病理診斷，并對病變組織的范圍進行標記; 按照實驗目的設計組織芯片陣列的組織類型和排列方式; 在組織數(shù)據(jù)庫中選擇合適的組織病例編號; 按照組織病例編號從組織庫中取出組織蠟塊和對應的HE染色切片; 用組織包埋機制備合適的空白受體蠟塊; 用組織陣列儀按照陣列設計抽提病理蠟塊組織芯，并有規(guī)律的排列在空白受體蠟塊上; 組織陣列塊在52 ℃恒溫烤箱中加熱融合，使組織芯與受體蠟塊緊密相連; 用全自動組織切片機以20 μm/轉的進刀速度對組織陣列塊進行修整蠟塊，直至80%的組織芯完全曝露; 用全自動組織切片機以4 μm/轉的進刀速度對組織陣列塊進行切片，切片附在防脫片處理的進口載玻片上; 陣列切片置于60 ℃恒溫烤箱中，烤片16 h; 組織芯片按編號每隔10張抽取1張做HE染色; 病理醫(yī)生對抽檢組織芯片中每一個組織樣本進行復診質檢，結果輸入組織芯片數(shù)據(jù)庫; 組織芯片實驗白片保存在切片盒中，置于冰箱5 ℃冷藏室保存; 對使用過的病理組織蠟塊進行封蠟，并將其和對應的HE染色切片歸位放回蠟塊柜和切片盒。作者制作1張組織芯片，共包含了56例膀胱癌組織(黑點)和10例癌旁組織(白點)。每個點代表一個組織樣本，每組組織樣本含有完整的臨床病理資料。見圖1。

1.3.2 免疫組化: 將制作好的組織芯片放入烘箱中，溫度調至63 ℃, 烘蠟1 h。烘蠟過程中配置好試劑，即10倍濃縮PBS緩沖液和抗原修復液(pH值=5.96)。片子烘烤完成后，從烘箱內取出，放入全自動染色機中，進行脫蠟。脫蠟過程有3個步驟: 首先二甲苯2缸，每缸15 min; 然后無水乙醇2缸，每缸7 min; 90%酒精1缸, 5 min; 80%酒精1缸, 5 min; 70%酒精1缸, 5 min。從染色機中取出片子，用純水沖洗3次, 1 min/次。沖洗過程中將檸檬酸修復液放在電磁爐上開始加熱。檸檬酸高壓修復: 檸檬酸修復液沸騰后，將片子放入高壓鍋中，蓋上高壓鍋蓋，待出氣后開始計時(長出氣)。計時2 min, 到時間后終止加熱，將高壓鍋蓋打開，將其放在水池中冷卻30 min。配制內源性過氧化物酶阻斷劑。將片子放入阻斷劑中15 min。取出片子，用PBS緩沖液沖洗3次, 1 min/次。冰箱中取出PRMT5一抗，放入離心機以7 200轉離心30 s; 在滴加一抗之前，用免疫組化筆畫出所要滴加一抗的組織范圍，保持濕盒水平放置，滴加動物非免疫血清，室溫孵育10 min。取出一抗，按照稀釋度1∶50用DAKO抗體稀釋液稀釋。保持濕盒水平放置，滴加一抗，放入冰箱4度過夜。第2天，從冰箱取出濕盒，保持濕盒水平放置，室內放置30～45 min, 讓濕盒恢復到室溫狀態(tài)。將片子用PBS緩沖液沖洗3次, 1 min/次。滴加DAKO公司的EnVisionTM+/HRP兔工作液，孵育30 min。到時間后用PBS沖洗3次, 1 min/次。從冰箱里取出DAB試劑盒，按1 mL DAB稀釋液+1滴DAB色原進行配制。在片子上滴加稀釋后的DAB(滴加之前最好在濕盒下面鋪好白色的紙張，以便于看清顯色情況)，顯色5 min(按照實際情況，染色不再加深可即可停止顯色)，到時間后自來水沖洗5 min。片子浸泡在哈氏蘇木素1 min, 到時間后在0.25%的鹽酸酒精中浸沒3～4 s, 用自來水沖洗2 min。將片子放入65 ℃烘箱或者通風櫥自然晾干，直至片子沒有水分，用中性樹膠封片。

1.3.3 結果判定: 將使用膀胱癌組織芯片進行實驗產生的所有PRMT5抗體的原始實驗數(shù)據(jù)納入本次統(tǒng)計分析。原始實驗數(shù)據(jù)的判讀方式: 判讀PRMT5的胞漿、胞核染色的染色強度(0、+、、)和染色陽性率，癌組織和癌旁組織(上皮)分別判讀。原始實驗數(shù)據(jù)的標準化方案: ① 染色強度評分: 0分(陰性), 1分(+), 2分(), 3分()。② 染色陽性率評分: 0分(陰性), 1分(1%～25%), 2分(>25%～50%), 3分(>50%～75%), 4分(>75%～100%)。③ 總評分: 以"染色強度評分"和"染色陽性率評分"的乘積為總評分。④ 生存期分析分組: 總評分≤4為低表達組，總評分>4為高表達組。

1.4 統(tǒng)計學方法

配對t檢驗用于比較19對膀胱癌患者癌組織及癌旁組織中PRMT5基因表達差異。將PRMT5基因表達按中位數(shù)分成高、低表達組，采用Kaplan-Meier方法分析并繪制生存曲線，以及Log-rank方法比較膀胱癌患者PRMT5高、低表達組的生存情況。應用χ2檢驗比較PRMT5基因表達高、低組間的性別、TNM分期以及有無復發(fā)等臨床特征差異。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側概率檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。使用的統(tǒng)計學軟件為SAS統(tǒng)計軟件 (v.9.2; SAS Institute, Cary, NC)。

2 結 果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫結果

2.1.1 PRMT5在配對的膀胱癌癌組織與癌旁組織中的表達差異: 下載了TCGA數(shù)據(jù)庫中的膀胱癌患者的基因表達譜，其中匹配的癌和癌旁組織一共有19對。通過配對t檢驗比較這19對膀胱癌患者癌組織及癌旁組織中PRMT5基因的表達水平，結果顯示PRMT5在膀胱癌組織中的表達水平顯著高于在癌旁組織中的表達水平(P=0.0001)。見圖2。

2.1.2 PRMT5基因表達與膀胱癌患者生存的關聯(lián)性: 本研究下載了TCGA數(shù)據(jù)庫中349例膀胱癌患者的基因表達譜及預后信息，并探討PRMT5表達水平與膀胱癌預后的關系。將PRMT5的表達量從低到高進行排序，取表達量中位數(shù)為標準，分為PRMT5低表達組和PRMT5高表達組。采用Kaplan-Meier方法分析并繪制生存曲線，接著通過Log-rank方法比較膀胱癌患者在PRMT5高低表達組中的生存情況。結果顯示PRMT5高表達組的膀胱癌患者較低表達組膀胱癌患者的預后更差(Log-rankP=2.6×10-4)。見圖3。

2.1.3 PRMT5基因表達與膀胱癌患者的臨床特征的相關性:作者整理了349例膀胱癌患者的相關臨床信息，包括年齡、臨床分期、病理分級、腫瘤大小以及有無淋巴結轉移等，探討PRMT5表達水平與膀胱癌的關系。將PRMT5的表達量按中位數(shù)為標準，分為低表達組和高表達組。應用χ2檢驗比較PRMT5基因表達高、低組的性別、TNM分期以及有無復發(fā)等臨床特征差異。結果顯示PRMT5高表達更傾向于分布在浸潤深度T3、T4(P=0.047), TNM分期T3、T4期(P=0.017)和新發(fā)腫瘤組中(P=0.007)。見表1。

表1 膀胱癌患者PRMT5基因表達與臨床特征的相關性

2.2 組織芯片結果

2.2.1 PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結果: 采用組織芯片-免疫組化技術檢測PRMT5在膀胱癌和癌旁組中的表達水平，46例膀胱癌組織和10例癌旁組織的檢測結果見表2、3、4、5、6、7、8。結果包括PRMT5在每個樣本胞漿和胞核中的染色強度和染色陽性率。

2.2.2 PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的表達: 按結果判定標準，將染色強度和染色陽性率轉化為相應的評分，然后以“染色強度評分”和“染色陽性率評分”的乘積為總評分來定量表達PRMT5在膀胱癌和癌旁組織中的蛋白表達水平。應用成組t檢驗比較2組間PRMT5的表達水平，結果無顯著差異(P=0.563)。接著分別觀察PRMT5在2組細胞胞核和細胞質中的表達水平，結果也無顯著差異(P=0.404、0.925)。見圖4。

2.2.3 PRMT5蛋白表達與膀胱癌癌患者生存時間的關系: 將PRMT5蛋白表達量的總評分從低到高進行排序?？傇u分≤4為PRMT5低表達組，總評分>4為PRMT5高表達組。采用Kaplan-Meier方法分析并繪制生存曲線，接著通過Log-rank法比較膀胱癌患者在PRMT5高、低表達組中的生存情況。結果顯示2組膀胱癌患者的生存時間無顯著差異(Log-rankP=0.285)。分別在細胞核和細胞質中探討PRMT5的表達水平與膀胱癌患者生存時間的關系，結果也無顯著差異(Log-rankP=0.723、0.298)。見圖5。

表2 A行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結果

表3 B行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結果

表4 C行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結果

表5 D行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結果

表6 E行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結果

表7 F行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結果

表8 G行PRMT5在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的染色結果

2.2.4 不同臨床病理參數(shù)與膀胱癌患者生存時間的關系: 結合膀胱癌組織的臨床病理參數(shù)，將膀胱癌樣本分為有淋巴結轉移和無淋巴結轉移，比較2組患者生存時間。結果顯示，有淋巴結轉移的膀胱癌患者預后更差(Log-rankP=0.031)。將膀胱癌樣本按病理分期分為Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期。結果顯示位于Ⅲ、Ⅳ期的膀胱癌患者預后更差(Log-rankP=0.015)。見圖6。

A. 有、無淋巴轉移; B. 不同病理分期

3 討 論

Jeon JY等[31]發(fā)現(xiàn)PRMT5在肝細胞癌和結腸癌細胞中的過表達有助于其獲得侵襲性等特征，因此有希望為這些疾病提供新的治療靶點。PRMT5作為一種表觀遺傳酶，能夠對稱性地甲基化組蛋白或者非組蛋白底物的精氨酸殘基，影響靶基因的表達或者信號分子的翻譯后修飾，進而調節(jié)多種細胞過程，發(fā)揮著不同生物學功能。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)集，證實PRMT5在膀胱癌中顯著高表達，且其表達水平與腫瘤浸潤深度、分化程度等顯著相關，即惡性程度越高的患者, PRMT5的表達越高。本研究顯示PRMT5表達和預后生存具有顯著的相關性, PRMT5高表達患者預后差，提示PRMT5基因在膀胱癌中有可能作為臨床預后指標。Dai Shimizu團隊同樣發(fā)現(xiàn)PRMT5可能作為肝細胞癌的致癌基因, PRMT5 mRNA水平有希望成為一種預后標志物，也可能成為肝細胞癌分子治療的潛在靶點[32]。本研究采用組織芯片-免疫組化技術檢測PRMT5在膀胱癌和癌旁組中的表達水平，結果未發(fā)現(xiàn)PRMT5在2組間存在表達的差異。接著通過Log-rank方法比較膀胱癌患者在PRMT5高低表達組中的生存情況，結果顯示2組膀胱癌患者生存時間無顯著差異。但是結合膀胱癌組織的臨床病理參數(shù)，顯示有淋巴結轉移的膀胱癌患者預后更差，位于Ⅲ、Ⅳ期的膀胱癌患者預后更差。

本研究中還存在著一些不足: 首先，本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫來探討PRMT5 mRNA在膀胱癌癌組織與癌旁組織中的表達以及與膀胱癌患者生存的關聯(lián)性，并沒有在自己樣本中進一步驗證; 其次，本研究采用組織芯片-免疫組化技術檢測PRMT5表達水平，探討生存預后關系，但結果都無顯著差異，這可能與樣本數(shù)量有限，或者前期在挑選樣本時存在選擇偏倚以及一些隨訪中斷等問題有關。

大量證據(jù)表明PRMT5可能是臨床腫瘤篩查的重要標志物，被認為是藥物治療的一個十分有價值的靶標。本研究結果進一步說明了PRMT5異常表達與膀胱癌的臨床參數(shù)及預后都存在著密切關系，為進一步研究PRMT5在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制以及開發(fā)特異性PRMT5抑制劑提供了新線索和新思路。