GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與急性腦梗死的相關(guān)分析

郭 丹，劉 丹，張廣煒

GALNT2 基因?qū)儆诙嚯?N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族中的一員 ，其主要功能是參與O-糖基化的第一步反應(yīng)[1]。在已知的研究中表明GALNT2基因內(nèi)中1q42突變與血漿中高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)與甘油三酯(triglyceride，TG)水平有關(guān)[2]，它是脂蛋白脂肪酶(LPL)的抑制劑，LPL在極低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒中水解TG，影響HDL-C和TG水平[3]。近些年來(lái)，DNA甲基化已成為新的研究熱點(diǎn)，是指S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)上的甲基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyl transferase,DNMT)的催化作用下,與胞嘧啶的C5位結(jié)合形成甲基胞嘧啶(5 mC)的化學(xué)修飾過(guò)程[4]。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG異二核苷酸上，主要集中于CpG島，而該區(qū)域主要集中于一些基因的啟動(dòng)子區(qū)，而CpG島的甲基化可以使一些轉(zhuǎn)錄因子無(wú)法與DNA結(jié)合而抑制基因的轉(zhuǎn)錄，最終影響基因的表達(dá)。已知GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的轉(zhuǎn)變將會(huì)影響基因的表達(dá)，降低HDL-C,升高TG，引起脂質(zhì)代謝紊亂，促使動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成與發(fā)展。而本課題主要是研究GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與急性腦梗死之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 病例組隨機(jī)選擇在我院神經(jīng)內(nèi)科2017年9月-2018年10月住院的急性腦梗死患者84例,均為漢族 ,彼此無(wú)親緣關(guān)系。對(duì)照組選擇同一時(shí)間段來(lái)我院住院的非急性腦梗死患者90例。 病例組入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18 歲；(2)發(fā)病時(shí)間≤7 d；(3)腦梗死診斷符合1996年全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)頭部CT或MRI檢查證實(shí)。 病例組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往曾有腦出血病史或CT顯示存在腦出血;(2)有明顯的心、肝、腎功能不全及惡性腫瘤;(3)存在心房顫動(dòng)等嚴(yán)重心律失常;(4)心源性栓塞所致的卒中。

1.2 方法與分組 病例組與對(duì)照組于入院次日清晨采集肘靜脈血共計(jì)2 ml，用抗凝管編號(hào)后放入-20 ℃低溫冰箱保存。進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA和基因組DNA純化回收，甲基化特異性 PCR(Methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)檢測(cè)和瓊脂糖凝膠電泳判定甲基化結(jié)果，用BECKMAN LX20全自動(dòng)生化儀(美國(guó) Beckman Coulter公司)測(cè)膽固醇(total cholesterol，TC)、TG、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)。

2 結(jié) 果

2.1 病例組和對(duì)照組的一般資料和臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)比P值來(lái)源于獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示年齡、性別、空腹血糖、TC、TG、LDL-C的組間P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而收縮壓、舒張壓、抽煙史、飲酒史、HDL-C的組間P值<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

2.2 GALNT2基因甲基化特異性PCR檢測(cè)結(jié)果 采用甲基化和非甲基化特異性引物擴(kuò)增被亞硫酸氫鹽修飾轉(zhuǎn)化后的對(duì)照組和病例組DNA時(shí)，GALNT2甲基化引物與非甲基化引物擴(kuò)增得到預(yù)期大小的擴(kuò)增片段如(見(jiàn)圖1)。

在檢測(cè)的急性腦梗死組患者血液標(biāo)本GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性人數(shù)為45人，其甲基化陽(yáng)性率為53.57%，而對(duì)照組陽(yáng)性人數(shù)為25人，其甲基化陽(yáng)性率為27.78%，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 GALNT2基因甲基化特異性PCR檢測(cè)電泳圖。M：甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物;U：非甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 病例組與對(duì)照組一般資料、臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)、GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的相關(guān)性分析 分別對(duì)病例組與對(duì)照組和年齡、性別、抽煙、飲酒、血壓、血脂及GALNT2基因甲基化情況進(jìn)行Pearson線性相關(guān)或Spearman秩相關(guān)分析(正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析)，結(jié)果顯示：急性腦梗死與抽煙(r=0.349，P=0.000)、飲酒(r=0.162，P=0.033)、收縮壓(r=0.259，P=0.001)、GALNT2基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性情況(r=0.263，P=0.000)均為正相關(guān)；而與HDL-C(r=-0.255，P=0.001)為負(fù)相關(guān)，表明抽煙、飲酒、高血壓、GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性與低的HDL-C均為急性腦梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素(見(jiàn)表2)。

2.4 急性腦梗死發(fā)病危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析 將急性腦梗死與其危險(xiǎn)因素進(jìn)行相關(guān)分析中的P<0.05的各變量進(jìn)行Logistic回歸分析，在校正其他危險(xiǎn)因素后，結(jié)果顯示：抽煙史、收縮壓、HDL-C、GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性與急性腦梗死的發(fā)病明顯相關(guān)，可能是急性腦梗死發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。其中GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化每增加1倍，急性腦梗死發(fā)病率增加2.346倍(95%CI1.160～4.743)(見(jiàn)表3)。

表1 病例組和對(duì)照組的一般資料與臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)對(duì)比

病例組與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01

表2 病例組與對(duì)照組一般資料、臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)、GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的相關(guān)性分析

注：*P<0.05，**P<0.01，r為相關(guān)系數(shù)，P為對(duì)年齡、性別、抽煙、飲酒、血壓、血脂、GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化指標(biāo)進(jìn)行Pearson線性相關(guān)分析或Spearman秩相關(guān)分析的P值

表3 急性腦梗死發(fā)病危險(xiǎn)因素的Logistic 回歸分析

3 討 論

急性腦梗死占我國(guó)腦卒中的69.6%～70.8%[5]，其中有大約75%的人存在不同程度的勞動(dòng)力喪失和生活不能自理，同時(shí)有大約1/4～3/4的腦梗死患者在2～5 y內(nèi)會(huì)發(fā)生新的腦梗死。隨著人們生活水平的提高，生活方式的改變，脂質(zhì)代謝紊亂對(duì)腦梗死的影響成為目前的研究熱點(diǎn)。而脂代謝紊亂是AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，通常表現(xiàn)為HDL-C水平顯著降低和(或) TC、TG、LDL-C水平明顯升高[6]。脂質(zhì)代謝失衡誘發(fā)炎癥反應(yīng)，AS的起始是由于動(dòng)脈壁破壞、動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的炎癥趨化因子導(dǎo)致白細(xì)胞遷移，而吞噬了脂質(zhì)的單核細(xì)胞或組織細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合則形成了泡沫細(xì)胞，膽固醇是組成泡沫細(xì)胞的主要物質(zhì)。脂質(zhì)代謝紊亂與炎癥反應(yīng)是AS形成的兩個(gè)必備條件。而與脂代謝紊亂有關(guān)的GALNT2基因甲基化的改變是否是腦梗死的危險(xiǎn)因素則成為我們今天的研究熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，HDL-C水平降低是急性腦梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素，線性相關(guān)分析顯示與急性腦梗死的發(fā)病呈負(fù)相關(guān)，且經(jīng)過(guò)Logistic回歸分析表示低的HDL-C是急性腦梗死發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素與已有的研究在AS引發(fā)的心腦血管疾病中，HDL-C的升高是與主要的危險(xiǎn)因素相吻合[7]。

本研究中，在入組的急性腦梗死的患者中，GALNT2甲基化陽(yáng)性率為53.6%，而對(duì)照組甲基化陽(yáng)性率為28%，明顯高于對(duì)照組，且與GALNT2甲基化陽(yáng)性呈正相關(guān)，這提示GALNT2基因甲基化的改變可能與急性腦梗死的發(fā)生有著密切的關(guān)系，且Logistic回歸分析顯示GALNT2基因甲基化改變是急性腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而且發(fā)現(xiàn)抽煙、飲酒、收縮壓異常也是急性腦梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素，且抽煙、飲酒、收縮壓與急性腦梗死呈正相關(guān)，并且經(jīng)過(guò)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)抽煙史、收縮壓為急性腦梗死發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與大量的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[8]，抽煙史與急性腦梗死發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素一致，這主要是因?yàn)闊煵葜械哪峁哦?、一氧化碳及焦油?huì)使內(nèi)皮細(xì)胞受損，引起內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)而加速AS的形成，從而引起急性腦梗死的發(fā)生。并且根據(jù)王薇等人[9]的調(diào)查研究表明，收縮壓/舒張壓增高，均會(huì)增加腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與本課題的研究結(jié)果收縮壓是急性腦梗死發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素相吻合。

本課題的不足之處：我們已知的腦梗死的危險(xiǎn)因素糖代謝異常、血脂代謝紊亂、收縮壓和/或舒張壓的異常[10,11]，在本課題的研究中未得出陽(yáng)性結(jié)論，可能與患者正在服用降血糖藥物或應(yīng)用胰島素控制血糖、服用降壓藥物控制血壓、服用他汀類藥物調(diào)節(jié)血脂有關(guān)，也可能與納入的樣本量少，并且血壓采用的是入院時(shí)兩次測(cè)量血壓取平均值所得血壓，結(jié)果存在一定的局限性，需要后期進(jìn)行足夠多數(shù)據(jù)的臨床實(shí)驗(yàn)研究證明。

綜合以上的研究，我們可以發(fā)現(xiàn)GALNT2基因啟動(dòng)子甲基化,不僅可以引起脂質(zhì)代謝紊亂，還與急性腦梗死的發(fā)病存在密切的關(guān)系，所以通過(guò)檢測(cè)GALNT2基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況來(lái)預(yù)測(cè)急性腦梗死的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也為急性腦梗死的基因治療和預(yù)防提供了的新思路。