腦脊液和海馬組織兒茶酚胺氧位甲基轉移酶與阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶功能的相關性研究

陳 坤,卜淑芳,劉喜燦

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)多見于老年人，俗稱老年性癡呆,其主要臨床癥狀為認知障礙和記憶能力損傷等，是一種中樞神經系統退行性變性疾病[1]。隨著人口老齡化的加劇，阿爾茨海默病嚴重危害了老年人的生命健康，患病率隨著年齡的增加而升高[2]，目前全世界阿爾茨海默病患者已超過2400萬人。由于阿爾茨海默病的病因復雜，當前的治療手段效果并不理想。兒茶酚胺氧位甲基轉移酶(catechol O-methyl-transferase，COMT)是一種參與兒茶酚雌激素代謝反應的關鍵酶，對雌激素導致的DNA損傷具有保護作用[3]。研究發現，兒茶酚胺氧位甲基轉移酶可編碼兩條不同的mRNAs：可溶性的COMT(S-COMT)和膜結合型COMT(MB-COMT)[4]。研究證實，COMT在腫瘤組織中高表達，如結直腸癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌和子宮內膜癌等[5]。COMT作為一種參與兒茶酚胺類神經遞質滅活的主要降解酶，與去腎上腺素和多巴胺的代謝密切相關[6]。因此，研究COMT 酶學活性對神經性疾病的治療具有重要意義。因此，本研究通過腦立體定位儀向SD大鼠海馬CA1區注射Aβ25-35，建立阿爾茨海默病大鼠模型，探究腦脊液和海馬組織兒茶酚胺氧位甲基轉移酶與阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶功能的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 實驗動物：健康雄性SD老年大鼠(18～20個月)40只，體重為400～600 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。生長溫度為(23±2)℃，環境濕度為45%～50%，光照時間為每天12 h，自由進食、進水，適應性飼養1 w。主要試劑：BCA 蛋白濃度測定試劑盒及ECL發光試劑盒購自碧云天生物技術研究所；COMT抗體和β-actin抗體均購自Abcom公司；其余為國產分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及給藥 選取40只健康雄性SD老年大鼠(18～20個月齡)，隨機分為假手術(Sham)組和阿爾茨海默病模型(Model)組，每組20只。經腦立體定位儀向SD大鼠海馬CA1區注射Aβ25-35，建立阿爾茨海默病大鼠模型。模型建立具體操作步驟：將SD大鼠進行腹腔麻醉后，固定在腦立體定位儀上。根據《大鼠腦立體定位圖譜》，確定大鼠腦部海馬CA1區位置，并在兩側海馬區各注射1 μl的Aβ25-35，假手術組注射等量的生理鹽水。注射結束后，對大鼠腦部進行縫合。

1.2.2 行為學觀察 本實驗采用電刺激逃避即跳臺法對大鼠的行為學進行觀察。大鼠的學習記憶功能的觀察指標為實驗過程中各個大鼠出現的錯誤反應次數和潛伏期。(1)實驗裝置：跳臺裝置為 120 cm×80 cm×24 cm 的有機玻璃箱，刺激電極為箱底鋪的銅柵。將箱子平均分為5格，大鼠回避電擊的安全臺為每格內分別放置的高8.5 cm，直徑10.5 cm 的橡膠墊;(2)實驗過程：將大鼠放入試驗箱內適應5 min，以36 V交流電對鼠進行電擊。大鼠在遭電擊后逃上橡膠墊，再從橡膠墊上跳下，以雙足接觸銅柵遭到電擊為錯誤反應次數一次。首先，對大鼠進行3 min的訓練，并記錄錯誤反應次數。24 h后再進行測驗。實驗方法同上，以大鼠首次從橡膠墊跳下時開始計時，作為大鼠觸電潛伏期，并以大鼠第一次和第二次測試過程中出現的錯誤次數作為學習記憶功能的觀察指標。

1.2.3 qPCR法檢測各組大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的基因表達 實驗結束后，對各組大鼠進行斷頭處死，并分離出腦部腦脊液和海馬組織。采用組織勻漿機分別對腦脊液和海馬組織進行充分研磨。采用Trizol提取法提取血管中的總RNA，按照Micro RNA 反轉錄試劑盒說明書對總RNA進行反轉錄。反轉錄體系為20 μl：1 μl總RNA，4 μl 5×Reaction Mix，2 μl 10×Super Script Enzyme Mix，加入雙蒸水將體系補足至20 μl，混勻后離心。反應條件為：37 ℃下60 min，95 ℃下5 min，置于4 ℃保存備用。按照q-PCR試劑盒說明書進行轉錄擴增，反應體系為20 μl。使用SYBR Green染料法進行測定，每個樣本設置4個復孔。按照試劑盒說明書的反應條件進行擴增。基因的相對表達量用2-△△CT法進行計算。

1.2.4 Western blot法檢測各組大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的蛋白表達 各組大鼠在實驗結束后進行斷頭處死，迅速分離出大鼠大腦腦脊液和海馬組織，并保存于-80℃備用。提取組織蛋白，采用Western blot檢測腦脊液和海馬組織中COMT的蛋白表達水平。分別將大鼠的腦脊液和大腦海馬組織置于研缽中，加入一定體積的蛋白裂解液對組織進行充分研磨，于冰上裂解30 min后，在4 ℃下、12 000×g離心10 min，吸取上清液，并使用BCA蛋白濃度試劑盒對其進行蛋白定量。選取5%的濃縮膠和10%的分離膠，取20 μl蛋白樣品進行上樣，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上。使用10%的脫脂乳粉溶液進行封閉2 h后，一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜。使用TBST洗膜3次，每次15 min，二抗(1∶4000)室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次。使用化學發光法對蛋白進行顯色。

2 結 果

2.1 阿爾茨海默病對大鼠的逃避行為潛伏期影響 與假手術組比較，阿爾茨海默病模型組大鼠的潛伏期明顯縮短(P<0.01)，說明阿爾茨海默病對大鼠的逃避行為潛伏期有著消極的影響(見表1)。

2.2 阿爾茨海默病對大鼠的學習記憶錯誤次數影響 阿爾茨海默病模型組大鼠錯誤(4.87±1.87)次顯著增加(P<0.01)，說明阿爾茨海默病嚴重損害了大鼠的學習記憶功能(見表1)。

2.3 各組大鼠腦脊液中COMT的mRNA表達情況 實時定量PCR(q-PCR)測定結果顯示，與假手術組相比，阿爾茨海默病模型組大鼠腦脊液中COMT的mRNA表達量均顯著升高(P<0.01)，說明阿爾茨海默病可提高大鼠腦脊液中COMT的mRNA表達量(見表1)。

2.4 各組大鼠海馬組織中COMT的mRNA表達情況 實時定量PCR(q-PCR)測定結果顯示，與假手術組相比，阿爾茨海默病模型組大鼠海馬組織中COMT的mRNA表達量均顯著升高(P<0.01)，說明阿爾茨海默病可提高大鼠海馬組織中COMT的mRNA表達量(見表1)。

2.5 各組大鼠腦脊液中COMT的蛋白表達情況 Western blot測定結果顯示，與假手術組相比，阿爾茨海默病模型組大鼠腦脊液中COMT的蛋白表達量顯著上調(P<0.01)，說明阿爾茨海默病可上調大鼠腦脊液中COMT的蛋白表達量，這與mRNA的表達結果相一致(見表1、圖1)。

2.6 各組大鼠海馬組織中COMT的蛋白表達情況 Western blot測定結果顯示，與假手術組相比，阿爾茨海默病模型組大鼠海馬組織中COMT的蛋白表達量顯著上調(P<0.01)，說明阿爾茨海默病可上調大鼠海馬組織中COMT的蛋白表達量，這與mRNA的表達結果相一致(見表1、圖2)。

表1 Model組和Sham 組大鼠的各項指標比較

圖1 各組大鼠腦脊液中COMT的蛋白表達情況

圖2 各組大鼠海馬組織中COMT的蛋白表達情況

3 討 論

阿爾茨海默病是一種原發性的退行性腦部疾病，其發病機制尚不明確，推測可能與基因突變、家族遺傳、神經遞質及生化改變、免疫功能紊亂、神經生長營養因子缺失、鋁中毒、能量代謝降低以及激素水平下降等因素有關[7]。當前的學者們提出了多種關于阿爾茨海默病的發病機制學說，包括膽堿能缺陷學說、β淀粉樣蛋白級聯學說、tau蛋白異常磷酸化學和氧化應激學說等[8]。臨床上治療阿爾茨海默病的藥物主要有抗氧化劑、膽堿酯酶抑制劑、神經營養因子、抗炎藥物和興奮性氨基酸等，但療效并不理想[9]。因此，探究阿爾茨海默病的發病機制，對其治療具有重要的意義。在阿爾茨海默病的發病早期，Aβ 沉積是發病的主要臨床表現和病理變化[10]。研究發現，大鼠海馬區的Aβ 沉積可對突觸傳遞和LTP造成破壞，并損傷大鼠的學習記憶功能[11]。Aβ生成過多和Aβ清除障礙是導致Aβ在AD患者腦內大量沉積的主要原因。研究證實，在小鼠腦內注射Aβ，可導致腦內海馬神經元大量凋亡[12]。因此，本研究經腦立體定位儀向SD大鼠海馬CA1區注射Aβ25-35，建立阿爾茨海默病大鼠模型，探究大鼠腦脊液和海馬組織中的兒茶酚胺氧位甲基轉移酶與阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶功能的相關性。

學習記憶功能主要分為獲得、鞏固和再現3個階段，是中樞神經系統中的重要高級功能[13]。電刺激逃避主要用于評價動物的學習記憶功能，大鼠錯誤反應次數和潛伏期能夠客觀反映出動物的認知過程，具有操作簡便、記錄數據準確等優點[14]。因此，電刺激逃避法已經廣泛于學習記憶功能的檢測。阿爾茨海默病的臨床表現主要為學習記憶功能的減退，因此，本研究測定了大鼠的學習記憶功能。有本研究結果發現，阿爾茨海默病模型組大鼠的潛伏期顯著縮短，錯誤次數顯著增加，發生了明顯的學習記憶功能障礙，阿爾茨海默病嚴重損害了大鼠的學習記憶功能。

兒茶酚胺氧位甲基轉移酶(COMT)廣泛表達于哺乳動物的多種組織中，主要分為膜分泌型和膜結合型兩種形式[15]。近年來的研究證實，COMT基因與多種腫瘤疾病的發生與發展相關，并在腫瘤組織中高表達，如子宮內膜癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等[16]。此外，COMT也廣泛分布于神經組織，主要生理功能是使多巴胺等兒茶酚胺類神經遞質失活，其機制是將甲基供體上的甲基轉移到兒茶酚胺的3位和4位羥基上。COMT可降解60%位于人類前額葉皮質的多巴胺。研究發現，大腦控制性皮質損傷后，COMT的表達持續增高，并與行動遲緩和認知功能失常有關[17]。本研究通過實時定量PCR法測定了大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的mRNA表達量，結果顯示阿爾茨海默病模型組大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的mRNA表達量均顯著高于假手術組，說明阿爾茨海默病可提高大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的mRNA表達量。同時，本研究還通過Western blot測定了大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的蛋白表達量，結果發現，阿爾茨海默病模型組大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的蛋白表達量顯著高于假手術組，說明阿爾茨海默病可上調大鼠腦脊液和海馬組織中COMT的蛋白表達量，這與mRNA的表達結果相一致。

綜上所述，阿爾茨海默病可嚴重損傷大鼠的學習記憶功能，并且首次揭示了COMT在AD大鼠腦脊液和海馬組織中mRNA和蛋白的高表達，證實腦脊液和海馬組織兒茶酚胺氧位甲基轉移酶的高表達與阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶功能具有顯著相關性。這將為阿爾茨海默病的發病機制和治療提供一定的理論依據。