阿柏西普對大鼠視網膜Müller細胞STAT3表達的影響

雷琦峰，蔡 維

作者單位:(442000)中國湖北省十堰市，湖北醫藥學院附屬東風醫院眼科

0 引言

Müller細胞為一種貫穿視網膜全層的放射狀膠質細胞，可與感光細胞以及其它的神經元緊密相連，可通過降解谷氨酸與攝取谷氨酸－天冬氨酸轉運蛋白攝取，從而發揮保護神經元的作用［1－2］。同時 Müller細胞是一種損傷誘導的干細胞，周圍環境的變化亦可影響Müller細胞功能［3－4］。絕大多數活化的Müller細胞都停留在幼稚階段，但是當視網膜下腔膠質瘢痕一旦形成，組織低氧壓引起視網膜血管和脈絡膜毛細血管灌注不足，血－視網膜屏障被破壞，加劇感光細胞凋亡［5］。因此研究Müller細胞調節機制有助于促進Müller細胞向神經元的分化。信號轉導及轉錄活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)是一類DNA結合蛋白，廣泛表達于不同類型的細胞和組織中，可參與細胞轉化、凋亡、生長、惡性轉化等過程［6－8］。阿柏西普是一種融合蛋白，其作為眼科一種新的抗血管生成物，利于減緩濕性黃斑水腫的進展速度，使機體中央視覺維持較長時間，其作用效能強于雷珠單抗或貝伐單抗［9－11］。本實驗探討了阿柏西普對大鼠視網膜Müller細胞STAT3表達的影響，希望為延緩視網膜色素變性疾病進程提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠永生化視網膜Müller細胞系購自美國Sigma公司(細胞培養在含有10%血清的DMEM培養基中，培養條件:5%CO2、37℃);DMEM細胞培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司;Annexin V－FITC PI細胞凋亡檢測試劑盒購于美國Invitrogen公司;MTT增殖檢測試劑盒購于美國Promega公司;兔抗人多抗［抗AKT抗體(68kD)、抗STAT3抗體(114kD)、抗GAPDH抗體(42kD)］購自英國Abcam公司;HRP抗兔二抗購自英國Abcam公司;阿柏西普購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖 將對數生長期的Müller細胞分別接種于96孔培養板中，每孔細胞密度為1×104個/mL(100μL)。按實驗分組，加入不同濃度的阿柏西普100μL(加藥濃度分別為 400、200、100pg/mL)，繼續培養24、48h 后加入 MTT 10μL，6h 后終止培養，每孔加入150μL DMSO，震蕩10min后，使用酶標儀540nm波長處檢測與計算增殖活性。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數生長期Müller細胞，調整細胞濃度至1×103個/mL，接種于6孔培養板。給予阿柏西普處理48h后收取細胞，加入200μL結合緩沖液重懸細胞，加入10μL Annexin V－FITC和5μL PI雙標記后，避光反應15min，采用流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.2.3 Transwell小室法檢測細胞侵襲 將5μg基質膠鋪于侵襲小室聚碳酯微孔膜的上表面，37℃放置30min。Müller細胞經阿柏西普處理48h后，在Transwell上室中分別添加細胞100μL，在下室加入到600μL培養基，培養48h后將其取出，固定并染色微孔膜下層細胞，在400倍光學顯微鏡下任意選取5個視野，對每個視野穿過微孔細胞數目進行計數，以侵襲穿透指數判定侵襲能力。

1.2.4 Western－blot法檢測蛋白表達 Müller細胞經阿柏西普處理48h后，收取細胞消化后提取細胞總蛋白，每組取20μg蛋白進行SDS－PAGE電泳，轉膜后過夜封閉，剪成對應大小的條帶放入各含有抗AKT抗體、抗STAT3抗體、抗GAPDH抗體的孵育盒中(稀釋比例為1∶1000)，4℃過夜，TBST洗滌后，再將膜置于相應種屬的二抗中(稀釋比例為1∶5000)，室溫孵育1h，TBST洗滌后進行 ECL顯色，檢測 GAPDH、AKT、STAT3蛋白表達水平。

統計學分析:所有實驗均獨立重復3次，統計學分析采用SPSS23.0統計學軟件進行分析，計量數據采用珋x±s表示，首先采用單因素方差分析進行三組間的比較，若存在差異，兩兩比較采用 LSD－t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

表1 不同濃度阿柏西普不同時間細胞增殖活性的變化(，%)

表1 不同濃度阿柏西普不同時間細胞增殖活性的變化(，%)

注:aP＜0.05 vs 100pg/mL阿柏西普組;cP＜0.05 vs 200pg/mL阿柏西普組。

阿柏西普濃度(pg/mL) 24h 48h 400 28.29±6.10a，c 45.69±5.11a，c 200 43.22±4.19a 66.66±6.44a 100 72.29±5.98 90.82±4.91 F 16.498 22.777 P＜0.01 ＜0.01

表2 不同濃度阿柏西普細胞凋亡率和侵襲穿透指數的變化(，%)

表2 不同濃度阿柏西普細胞凋亡率和侵襲穿透指數的變化(，%)

注:aP＜0.05 vs 100pg/mL阿柏西普組;cP＜0.05 vs 200pg/mL阿柏西普組。

阿柏西普濃度(pg/mL) 細胞凋亡率 侵襲穿透指數400 44.58±2.58a，c 9.48±6.33a，c 200 23.19±1.09a 20.17±3.92a 100 5.09±3.11 37.78±2.19 F 19.444 9.222 P＜0.01 ＜0.01

圖1 不同劑量阿柏西普作用后AKT和STAT3蛋白的表達。

2 結果

2.1 不同劑量阿柏西普作用后細胞增殖活性的變化 處理24、48h后，隨著阿柏西普濃度的升高，Müller細胞的增殖活性下降，差異有統計學意義(P＜0.05，表1)。

2.2 不同劑量阿柏西普作用后細胞凋亡率的變化 處理48h后，隨著阿柏西普濃度的升高，Müller細胞的凋亡率逐漸上升，Müller細胞的侵襲穿透指數逐漸降低，差異均有統計學意義(P＜0.05，表2)。

2.3 不同劑量阿柏西普作用后AKT和STAT3蛋白的表達 處理48h后，隨著阿柏西普濃度的升高，Müller細胞的AKT蛋白相對表達量無顯著變化(F=0.533，P=0.333);STAT3蛋白相對表達量逐漸降低，差異有統計學意義(F=9.30，P=0.001，圖 1)，兩組間比較，200pg/mL組和100pg/mL組、400pg/mL組差異均有統計學意義(t=8.294、10.482，P=0.012、0.001)。

3 討論

Müller細胞對視網膜發育和維持自身平衡都具有重要的作用，當前視網膜損傷情況下，Müller細胞可重新回到細胞周期，能夠大量活化和增殖，逆分化為視網膜干細胞，進而轉分化為視網膜各類細胞和神經元，完全替代損傷的細胞，恢復視網膜功能［11］。但是在哺乳動物中，Müller細胞的功能受限，只有少量逆分化的Müller細胞分化表達視網膜神經元，并能特異地向感光細胞分化［12－13］。

VEGF及其受體(VEGFR)的生成過度表達參與視網膜的損傷過程，嚴重影響患者視力［14］。VEGF為血小板衍生生長因子(PDGF)家族的重要一員，可增加血管通透性與促進血管和淋巴管的生成，是血管內皮細胞內高度特異性的血管生長和滲透因子［15］。VEGF的類型包括VEGFA、VEGF－B、VEGF－C、VEGF－D 等，其是由七個免疫球蛋白樣的結構域串聯而形成的膜外部分，膜內部組成具有酪氨酸激酶活性［16］。VEGF是參與糖尿病黃斑水腫病理生理過程的重要因子，高血糖、缺氧、外在損傷等病理條件可導致VEGF的上調，從而引起血管增生、血管滲漏等一系列病理過程［17］。阿柏西普的配體結合域融合了來自VEGF受體1、2及IgG1的Fc部分，其作為一種可溶性誘導受體來結合VEGF－A和胎盤生長因子，抑制同源VEGF受體的結合和激活，且阿柏西普與VEGF的親合力高，中和VEGF－A的效能強于雷珠單抗或貝伐單抗［18－19］。本研究顯示細胞處理24、48h后，隨著阿柏西普濃度的升高，Müller細胞的增殖活性下降，差異有統計學意義(P＜0.05)。處理48h后，隨著阿柏西普濃度的升高，Müller細胞的凋亡率逐漸上升，Müller細胞的侵襲穿透指數逐漸降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，表明阿柏西普的應用能降低Müller細胞增殖與侵襲性，提高細胞凋亡率。

當前研究表明，微環境中的細胞可通過分泌信號分子或者影響細胞間接觸影響干細胞/祖細胞的存活、自我更新、遷移、粘附［20］。STAT3由 750～850個氨基酸組成，分子量為84～113kDa。編碼STAT3的基因在人類定位于第12號染色體，在鼠科動物定位于第11號染色體。STAT3 mRNA在肝臟、睪丸、大腦、心臟和胸腺中含量較高，廣泛表達于不同類型的細胞和組織中［21－22］。STAT3具有亮氨酸拉鏈結構(bZIP)，其與中樞神經系統疾病、眼科疾病等多種病理生理過程有著密切的關系［23－24］。STAT3既可抑制轉錄，也可活化轉錄，其在調控細胞增殖、凋亡、免疫穩態、炎癥以及器官和組織的分化等方面具有重要功能。研究表明，當Müller細胞受損時細胞凋亡增加，凋亡相關標記物上調［25］。本研究顯示處理48h后，隨著阿柏西普濃度的升高，Müller細胞的AKT蛋白相對表達量無顯著變化(P＞0.05)，STAT3蛋白相對表達量逐漸降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，表明阿柏西普的應用可影響STAT3蛋白的表達。從機制上分析，阿柏西普可阻止VEGF與Fit－1的結合，抑制同源VEGF受體的結合和激活，從而抑制STAT3蛋白的表達。本研究也有一定的不足，沒有對阿柏西普的空白對照進行分析，也沒有明確阿柏西普的作用位點，將在下一步的實驗中進行深入分析。

總之，阿柏西普可抑制大鼠視網膜Müller細胞STAT3蛋白表達，從而抑制細胞增殖與侵襲性，促進細胞凋亡。