翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌體外抑菌活性及小鼠感染模型的防治效果研究

高 艷，郝寶成，吳金措姆，格桑卓嘎，拉巴次旦，班 旦，四郎玉珍，邢小勇，梁 云，楊志偉，胡永浩* ，梁劍平*

(1.甘肅農業大學動物醫學院甘肅蘭州730070;2.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農業部獸用藥物創制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州730050;3.西藏自治區農牧科學院畜牧獸醫研究所，西藏拉薩850009;4.蘭州市肺科醫院，甘肅蘭州730046)

牛出血性敗血癥，簡稱“牛出敗”，是由多殺性巴氏桿菌引起的牛急性熱性敗血性傳染病［1］，該病原是條件致病菌，機體抵抗力降低時病菌即可侵入體內大量繁殖［2］，除內源性感染發病外，也經呼吸道，消化道以及損傷皮膚和粘膜感染。易感動物為牛［3］，豬［4］等動物，發病死亡率高達 80%以上，痊愈牛雖可產生免疫力，但其生產性能出現一定幅度下降［5］。西藏牧區內，牛出敗常地方流行或零星散發，根據臨診癥狀，分為肺炎型、浮腫型和敗血型［6］，此病潛伏期為 2～5 d，多見犢牛［7］，發病牛多呈急性經過，死亡率高達40%～50%［8］，如芒康縣，林芝地區［9－10］等。近年來，西藏、青海［11］等主要牧區發病呈現上升態勢，不僅帶來巨大的經濟損失，且對草場和水源造成二次污染。

近年來，抗生素濫用導致臨床分離到的牛源多殺性巴氏桿菌耐藥菌株不斷增多，臨床抗感染治療效果越來越差，新疫苗研制開發周期較長，這些因素嚴重影響了對牛出血性敗血癥的臨床預防治療。有研究表明中藥或天然植物提取物可發揮對病原菌直接殺滅作用而不產生耐藥性或提高其對抗生素的敏感性［12－15］，如中藥“連黃”可降低巴氏桿菌的耐藥性［16］。利用中藥或天然植物提取物用于臨床疾病防治已逐漸成為研究熱點。藏藥因其生長環境得天獨厚，藥用成分含量高，藥性純正副作用低，臨床治療效果較好，已得到很多研究者的認可［17］。試驗利用該復方對引起牛出敗的多殺性巴氏桿菌進行體外抑菌活性研究及體內防治實驗，以期為臨床治療提供參考依據。

1 材料

1.1 藥材與菌種 鐵棒錘、訶子、藏木香、安息香、翼首草、兔耳草、草果、紅景天，均購自西藏亞郎藏藥材銷售有限公司。

多殺性巴氏桿菌(編號:CVCC1659)，購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心。

1.2 培養基 MH瓊脂培養基(Mueller－Hinton Agar，MHA)，MH 肉湯培養基 (Mueller－Hinton borth，MHB)均購自北京奧博星生物技術有限責任公司;LS4509增菌培養基，批號ZBAP－170716D，購自廣州市迪景微生物科技有限公司。

1.3 實驗動物 SPF級昆明(KM)小鼠共計240只，雌雄各半，體重(18±2)g，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心，批號為SCXK(甘)2015－0001，連續飼喂 7d，自由采食，飲水，觀察小鼠適應環境情況。

1.4 儀器和試劑 生物安全柜(HFsafe－1500，上海力申科學儀器有限公司);Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);恒溫培養振蕩器(HNYC－202T，天津歐諾儀器股份有限公司;VITEK 2 COMPACT儀器(梅里埃生物公司);沃特浦制水機(四川沃特爾水處理有限公司);CO2培養箱(TABAI ESPEC CORD，Japan);革蘭氏陰性細菌鑒定卡(產品批號2410112103，梅里埃診斷產品(上海)有限公司);注射用硫酸鏈霉素(產品批號:170103，合肥強力動物藥品有限責任公司);注射用青霉素鈉(產品批號:16050905－1，哈藥集團);紅景天苷對照品(購自于中國食品藥品檢定研究院，含量以 98.8%計，批號為 110818－201708);甲醇(色譜純)。

2 方法

2.1 翼草景香水煎液的制備 準確稱取各組分藥材，加10倍體積超純水水浸泡2 h，大火煮沸后連續煎煮2 h，四層紗布過濾，收集濾液，藥渣中再加入8倍體積超純水，大火煮沸后連續煎煮2 h，加四層紗布過濾，合并兩次濾液，烘干備用。

取9支10 mL無菌離心管，用二倍稀釋法將藥液分別稀釋為生藥濃度為 500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.8，3.91，1.95 mg/mL，標記為 2－1 ～ 2－9，4℃保存，以備牛津杯法中使用。

2.2 HPLC測定翼草景香中紅景天苷方法

2.2.1 色譜條件 kromasil－sb－c18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇:水=15 ∶85，柱溫為30℃，檢測波長275 nm，流速1 mL/min，進樣量10μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取紅景天苷對照品，溶于50%甲醇，配制成濃度為0.5615 g/L的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取復方提取物4.00098 g，置具塞錐形瓶中，加入10 mL甲醇，超聲處理30 min，離心取上清，重復一次，合并兩次上清于25 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，再將其轉移到50 mL容量瓶，用水定容至刻度，經 0.22μm濾膜過濾后備用。

2.2.4 標準曲線 將紅景天苷對照品分別稀釋為0.56150000、0.28075000、0.14037500、0.07018750、0.03509375 g/L的工作標準液，經 0.22 μm 濾膜過濾后待進樣。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，求其回歸方程及相關系數。

2.2.5 精密度試驗 取濃度為0.14037500 g/L的工作標準液重復進樣6次，測定其峰面積的RSD。

2.2.6 穩定性試驗 取一供試品溶液分別于 0，2，4，8，12，24 h 進樣，測定其峰面積的 RSD，考察樣品的穩定性。

2.2.7 重復性試驗 取同一批次樣品六份，按2.2.3制備供試液，按色譜條件進樣，計算樣品含量，峰面積RSD值。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知濃度的樣品1 mL，分別在其中加入不同體積的工作標準液(濃度為0.56150000 g/L)1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mL，按色譜條件計算供試樣液回收率及RSD值。

2.3 菌懸液的計數和制備 將原菌液進行7次10倍稀釋，吸取100μL稀釋液于MHA平皿涂布均勻，重復3次，37℃恒溫培養箱中培養18 h，對菌落進行計數，求平均值，將菌液稀釋為1×106CFU/mL，現用現配。

2.4 牛津杯法測定翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌抑菌作用 按向雙云等［18］做牛津杯的方法進行試驗，對照組為無菌水，每個藥液濃度重復3次，4℃冰箱放置2h，37℃恒溫培養18 h，測量抑菌圈直徑，取平均值。

2.5 翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌的MIC值根據美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute)制定的微生物臨床檢驗標準，取12支試管，依次標記為1～12，按向雙云等［18］利用試管2倍稀釋法測定MIC值，試管1～10生藥濃度依次為 250，125，62.5，31.25，15.63，7.8，3.91，1.95，0.98，0.49 mg/mL。試管 11 為陰性對照，12為空白對照，37℃搖床培養18 h，將培養物接種于MHA培養基，平板標記為2－1～2－11，37℃恒溫培養18 h，并設3個重復平行組。

2.6 小鼠體內感染多殺性巴氏桿菌模型的建立將SPF級昆明小鼠132只，隨機分11組，A～K組每組12只，雌雄各半。將原菌液10倍稀釋為108～102CFU/mL，A－G組依次腹腔注射菌液濃度為1×108～1×102CFU/mL 100 μL，H 組腹腔注射濃度 1×102CFU/mL菌液50μL，連續觀察3 d。并將菌液濃度為1×102CFU/mL 50μL進行3次重復，統計小鼠死亡率。

試驗結束后，將存活小鼠處死并解剖，觀察病理變化，并取一部分小鼠肺臟組織做細菌涂片染色，鏡檢。同時將病料接種于MHA培養基中，劃線挑取單個菌落，將其配制為0.50－0.63麥氏濃度的菌懸液，利用全自動微生物鑒定及藥敏系統(VTEK 2 COMPACT)進行細菌鑒定。

2.7 翼草景香水煎液對小鼠體內感染多殺性巴氏桿菌防治作用 將SPF級昆明小鼠108只，雌雄各半，隨機分為9組，分別為預防組1～3、治療組1～3、陽性對照組、陰性對照組、空白對照組。預防組1～3分別連續 5 d 灌服 0.1、0.3、0.5 mL 生藥濃度為125 g/L藏藥復方水煎液，在第5 d給藥后1 h，每只小鼠腹腔注射50μL多殺性巴氏桿菌菌液;治療組每只小鼠腹腔注射50μL多殺性巴氏桿菌菌液，感染 1 h 后，分別灌服 0.1、0.3、0.5 mL 生藥濃度為125 g/L藏藥復方水煎液1次;陽性對照組感染多殺性巴氏桿菌1 h后按每千克體重肌肉注射2萬單位青鏈霉素混合藥液治療1次;陰性對照組在感染細菌1 h后，灌服0.5 mL無菌水1次;空白組灌服0.5 mL無菌水1次，正常采食，飲水。將各試驗組小鼠飼喂于相同環境中，觀察統計3 d內小鼠精神狀況及死亡情況。

3 結果與分析

3.1 HPLC法測定翼草景香紅景天苷含量結果

3.1.1 標準曲線 按色譜條件進樣求出其回歸方程為 y=3281.6x+3.965，r2=0.9999，紅景天苷進樣量在 0.03509375～0.56150000 g/L 之間峰面積與進樣量呈良好線性關系，見圖1。

圖1 紅景天苷的標準曲線Fig 1 The standard curve of salidroside

3.1.2 精密度試驗 取濃度為 0.14037500 g/L的工作標準液重復進樣 6次，其平均峰面積為927.1369833，RSD=0.17%，表明儀器的精密度良好。

3.1.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于配制后 0，2，4，8，12，24 h 進行測定，供試品溶液 RSD值在0～8 h內為1.82%，0～24 h內為13.30%，故樣品在8 h內基本穩定，這時其峰面積為730.49461，供試品濃度為0.2214 g/L，則翼草景香水煎液中紅景天苷含量為 2019.78 mg。

3.1.4 重復性試驗 取同一批次樣品六份，按色譜條件進樣，其平均峰面積為 732.8506267，RSD=2.65%，表明樣品重復性良好。

3.1.5 加樣回收率試驗 由表1可知，紅景天苷的平均回收率為90.99%，RSD為4.35%。

3.1.6 復方濃度對應關系 結果見表2。

表1 加樣回收率試驗結果Tab 1 Results of recovery rate test

表2 復方生藥濃度與以紅景天苷標定復方濃度關系Tab 2 The relationship between the concentration of compound crude drug and Salidroside

3.2 牛津杯法測定翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌抑菌作用 翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌抑菌圈大小隨生藥濃度變化見圖2。當翼草景香水煎液濃度為0.49263 g/L時，對多殺性巴氏桿菌的抑菌圈平均直徑為28.5 mm，當翼草景香水煎液濃度大于等于0.00385 g/L時對多殺性巴氏桿菌有抑菌效果。

圖2 抑菌圈直徑大小隨藥物濃度的變化Fig 2 The diameter of bacteriostatic circle varies with the drug concentration

3.3 翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌的MIC值測定 結合圖2、表2及表3，翼草景香水煎液濃度大于0.00385 g/L時，培養皿中無細菌生長，小于0.00385 g/L時培養皿中均有細菌生長。因此，翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌的MIC值為0.00385 g/L。且由表3可看出，其最小殺菌濃度也是 0.00385 g/L。

表3 不同藥物濃度下的菌落生長數目Tab 3 The number of colonies at different drug concentrations

3.4 小鼠體內感染多殺性巴氏桿菌模型的建立感染多殺性巴氏桿菌后，小鼠出現精神沉郁，被毛逆立，食欲下降。感染試驗結束后各組試驗小鼠死亡統計情況如表4。小鼠剖檢可見肺臟有明顯點狀淤血、壞死，心臟血管明顯充血，肝臟上有散在的白色壞死點，腸道有鼓氣現象，取肺部組織做細菌涂片，革蘭氏染色菌體為紫紅色(圖3)，初步鑒定為革蘭氏陰性菌;利用全自動微生物鑒定及藥敏系統(VTEK 2 COMPACT)進行鑒定，結果表明，分離鑒定獲得細菌為多殺性巴氏桿菌的可信性為97%。并將菌液濃度為1×102CFU/mL 50μL注射感染小鼠，經3次重復平行試驗，SPF級昆明(KM)小鼠腹腔注射死亡率均為75%，表明致死率為75%的小鼠體內感染多殺性巴氏桿菌模型的建立成功。

表4 小鼠感染不同濃度菌液的死亡率Tab 4 Mortality in mice infected with different concentrations of bacteria

3.5 翼草景香水煎液對小鼠體內感染多殺性巴氏桿菌防治作用 預防組不同劑量小鼠死亡率為50%，41.7%，81.8%，治療組小鼠死亡率為 66.7%，50%，75%，陰性對照組小鼠死亡率為75%，陽性和空白對照組死亡率為0。如圖4所示，該翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌有一定防治作用，當給予每只小鼠含紅景天苷0.0369mg的復方時，具有顯著的預防作用，能明顯降低死亡率33%。

4 討論與結論

4.1 翼草景香組方 藏醫經典著作《四續》及《四部醫典》均詳細的記載了“對治”是藏藥治療疾病的基本原則，是藥味、性、效配方的理論依據。藏藥方劑組方主要遵循“主仆原則”，具體組方時又有君王、大臣、王妃、士兵藥的不同，與中藥的“君臣佐使”有所不同，藏醫多以藥效強弱來區別“君王、大臣”。藏醫組方時，對疾病的診斷需準確，明確疾病屬性和藥性之間的關系，藏藥藥性理論與中醫不同［19］，見表 5。

牛出血性敗血癥在中醫辯證上屬于疫癘之病，臨床上常以敗血為主要癥狀，屬于熱性病。藏醫上，該病是因為赤巴紊亂造成的熱性疾病，根據“對治”原則，治療該病應該選用具有寒、涼性質的藥物。翼草景香復方有八味藥組成，分別為翼首草，兔耳草，訶子，紅景天，安息香，草果，鐵棒錘，藏木香，在西藏牧區已用于牛出血性敗血癥臨床防治。其組方中翼首草含量最多，屬苦、寒藥物，是翼草景香復方的主藥，其水提物具有很好的抑菌效果［20］;《四部醫典》將兔耳草列為草藥類之首，味苦性寒，藏醫中兔耳草，訶子也多用于治療赤巴病［21－22］，此兩味藥含量雖少于翼首草，亦是翼草景香復方的主藥，鐵棒錘亦屬苦、寒藥物，雖具有毒性，但與訶子配伍使用能有效降低其毒性［23］。翼草景香復方使用翼首草，兔耳草，訶子清熱解毒，結合安息香，藏木香，草果等緩解癥狀，利用紅景天提高機體免疫力，組方組成符合疾病“對治”原則，遵循“主仆”原則，且試驗結果表明，翼草景香水煎液對牛出血性敗血癥致具有防治作用。

圖3 菌體革蘭氏染色結果(1000×)Fig 3 Cell Gram stain results

圖4 小鼠死亡率隨復方劑量的變化Fig 4 mice mortality varies with the compound dose

表5 藏醫五元、六味、八性、十七效與疾病對治簡表

4.2 高效液相色譜法測定翼草景香水煎液中紅景天苷含量 超高效液相色譜憑借其選擇性高，分離效果好，檢測靈敏度高等優點被運用于多個領域中，如化學分析，環境分析，藥物分析，食品分析［24］等，藥材的化學成分含量測定方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效毛細管電泳法、HPLC［25］等。

紅景天是復方主要藥材之一，紅景天苷作為紅景天的主要成分，其不具備抑菌作用，但可提高機體免疫力。因此，本文利用HPLC測定翼草景香水煎液中紅景天苷的濃度，并以此來標定該翼草景香水煎液濃度。利用100%甲醇溶解紅景天苷標品時，出現兩個相連的峰，經液相全波長掃描及分光光度計全波長掃描，確定其為一種物質，經試驗，利用50%甲醇溶解對照品時其峰形最對稱。在該色譜條件下，標準曲線、儀器精密度、樣品穩定性及重復性RSD值都良好，加樣回收率為90.99%，偏低，RSD值為4.35%，偏高，可能是由于該溶液為復方提取物，成分眾多，不同濃度下，中藥成分發生的相互作用程度不一。

4.3 翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌體外抑菌作用 研究中利用牛津杯法和試管二倍稀釋法測定翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌的體外抑菌活性，當翼草景香水煎液濃度為0.49263 g/L時抑菌圈平均直徑為28.5 mm，表明翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌高度敏感，且其MIC值為0.00385 g/L，比呂彪、曲徑等［26－27］研究的單味中草藥抑菌效果更顯著。

4.4 翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌感染模型小鼠治療效果 實驗動物疾病模型已被廣泛應用于醫學生物學的研究領域中，本文通過成功建立多殺性巴氏桿菌感染小鼠模型，研究了翼草景香水煎液對巴氏桿菌的體內防治作用，經觀察，小鼠感染巴氏桿菌后，20 h后無死亡情況，故治療及對照組均給藥1次，預防及治療的高劑量組0.5 mL反而出現治療組死亡率較高現象，可能由于感染細菌后小鼠的免疫力降低所致，當給予0.3 mL復方水煎液時，預防組降低死亡率33%，治療組降低死亡率25%。

目前，國內外對于牛出敗多采用疫苗預防［28－29］，但由于多殺性巴氏桿菌的莢膜型和血清型眾多，疫苗免疫具有特異性不能全面覆蓋［30］，或基層獸防人員缺乏技術培訓采取不正確的接種方式，接種劑量［31－32］等，牛出敗依舊每年發生，臨床上治療巴氏桿菌病多采用抗生素類藥物，多連續用藥3 d，長時間使用效果降低，中藥多作為后期護理使用或不用，使用藏藥復方防治更是未找到相關報道。因此，本文復方以翼首草作為主藥，其可入血成分有

綠原酸、獐牙菜苷等，有文獻報道綠原酸具有抑菌作用［33］，但在此復方是否為主要有效成分尚需進一步研究確定;紅景天與訶子中都含有沒食子酸，具有抗菌作用［34－35］。文中翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌感染小鼠具有明顯的防治作用，且預防作用強于治療作用。

4.5 結論 翼草景香為藏藥復方，在西藏部分牧區已用于牛出血性敗血癥臨床防治，本文通過液相定量復方中紅景天苷濃度為0.2214 g/L，體外及體內試驗證明翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌具有良好的體內、外抑菌活性，且其預防作用較治療作用明顯，這為牛出血性敗血癥的臨床藥物防治提供新的選擇。