辣蓼總黃酮提取工藝篩選及優(yōu)化

向 蓉，何立美，陳文露，高 彪，袁明貴，羅勝軍，徐志宏，彭新宇

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東省中獸藥工程技術(shù)研究中心，廣州510640)

辣蓼(Polygonum hydropiper Linn.) 為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)植物，別名蓼子草、紅辣蓼、斑蕉草等。全國(guó)各地均有分布，但主產(chǎn)于廣東、廣西及南方各省，生長(zhǎng)在水邊潮濕的地方［1］。全草均可入藥，本品味辛，性溫;具有祛風(fēng)利濕、消腫解毒、散淤止痛、止癢殺蟲(chóng)等功效;用于腸胃炎、痢疾、腹瀉、跌打腫痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、功能性子宮出血等;外用治皮膚濕疹、毒蛇咬傷等癥狀［2］。臨床研究表明，辣蓼具有殺蟲(chóng)、抑菌、消炎、抗病毒、抗氧化、抑腫瘤、鎮(zhèn)痛止血等多種生物活性［3－5］。因此在農(nóng)藥、醫(yī)藥、獸藥、食品及飼料添加劑等方面都有著良好的開(kāi)發(fā)前景，特別在畜禽安全健康養(yǎng)殖業(yè)和生產(chǎn)安全畜禽產(chǎn)品中有廣泛的應(yīng)用前景［6］。

黃酮類(lèi)是辣蓼的主要活性成分，目前已從辣蓼的不同部位中分離得到金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、3＇－甲基槲皮素、7，4＇－二甲基槲皮素、異鼠李素、山萘酚、兒茶素、表兒茶素等［7－10］。根據(jù)設(shè)備與操作方式不同，總黃酮的提取方法可分為:滲漉法、浸漬法、索氏提取法、加熱回流提取法等，不同操作方法各有優(yōu)劣。本文分別比較熱水提取法、超聲提取法、乙醇加熱回流法、索氏提取法對(duì)辣蓼總黃酮的提取效率，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化提取工藝，獲得最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料 蘆丁對(duì)照品(批號(hào):100080－200707，中國(guó)食品藥品鑒定研究院，純度≥98%);亞硝酸鈉(分析純，批號(hào)20120314，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);硝酸鋁(分析純，批號(hào) 20120304－2，廣州化學(xué)試劑廠);氫氧化鈉(分析純，批號(hào)12082311422，南京化學(xué)試劑有限公司);甲醇(分析醇，批號(hào)2013062005，廣州市東紅化工廠);辣蓼(廣東廣州，批次201309)經(jīng)廣東藥學(xué)院李書(shū)淵教授鑒定為蓼科植物水辣蓼Polygonum hydropiper Linn.。藥材經(jīng)低溫干燥后，粉碎，過(guò)20目篩，備用。

1.2 儀器 UV－3100PC紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);BS 123S Sartorius萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司);SHZD－D(Ⅲ)循環(huán)式水泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);RE－5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DL－720A超聲波清洗器(600 w，上海之信儀器有限公司);KQ－100B型超聲波清洗器(100 w，控溫0～85℃，昆山市超聲儀器有限公司);HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州奧華儀器有限公司)。

1.3 總黃酮測(cè)定方法建立

1.3.1 線性關(guān)系考察

1.3.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取蘆丁對(duì)照品10 mg，精密稱(chēng)量，置于10 mL容量瓶中，加60%乙醇適量，水浴40℃使溶解，放冷至室溫，加60%乙醇至刻度，搖勻，得蘆丁儲(chǔ)備液。精密量取5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液(每1 mL含蘆丁0.2 mg)。按NaNO2－Al(NO3)3－NaOH顯色體系進(jìn)行顯色，精密量取對(duì)照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6 mL，加5% 亞硝酸鈉溶液1.00 mL，混勻，放置6min;再加10%硝酸鋁溶液1.00 mL，搖勻，放置6min;加氫氧化鈉溶液10.00 mL，再加30%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白。

1.3.1.2 供試品溶液的制備 取樣品 1.0 g，精密稱(chēng)定，提取次數(shù)為2次，過(guò)濾，合并兩次濾液。取濾液1.0 mL置于 25 mL容量瓶中，按上述 NaNO2－Al(NO3)3－NaOH顯色方法進(jìn)行顯色，扣除背景后測(cè)定吸光度。

1.3.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 對(duì)照品溶液及供試液按以上顯色方法顯色后，按各自空白對(duì)照進(jìn)行校準(zhǔn)，在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。

1.3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 方法學(xué)考察

1.3.2.1 精密度試驗(yàn) 日內(nèi)精密度:取供試液1.25 mL于25 mL容量瓶中，顯色后于同一條件下測(cè)定6次吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得總黃酮濃度，計(jì)算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD來(lái)考察儀器日內(nèi)精密度。

日間精密度:取供試液1.25 mL于25 mL容量瓶中顯色后平行操作3份，測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得總黃酮濃度，同法連續(xù)操作3天，計(jì)算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD來(lái)考察儀器日間精密度。

1.3.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試液1.25 mL于25 mL容量瓶中，顯色后，定容，放置15 min后開(kāi)始計(jì)時(shí)，于 0、10、20、30、40、50、60 min 后，測(cè)定吸光度值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD來(lái)考察樣品顯色后的穩(wěn)定時(shí)間。

1.3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液1.25 mL于25 mL容量瓶中，顯色后平行操作6份，分別測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD來(lái)考察供試品的重復(fù)性。

1.3.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 平行取9份辣蓼粉末樣品，每份1.0g，精密稱(chēng)定，平均分成3組，按供試品處理方法處理后，各取5.0 mL分別加入一定量的對(duì)照品，使加入量分別約為化合物原始含量的80%(低濃度組)、100%(中濃度組)、和 120%(高濃度組)，顯色后測(cè)定其吸光度，計(jì)算加標(biāo)回收率及相應(yīng)的RSD值。

1.4 提取方法的篩選

1.4.1 熱水提取法 取辣蓼粉末100.00 g，第1次加8倍水浸泡2 h后，煎煮1.5 h，過(guò)濾，濾渣繼續(xù)加6倍水煎煮1 h，過(guò)濾，合并2次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，離心(3500 r/min，10 min)取上清液，濃縮至 1000 mL(生藥濃度 0.1 g/mL)。

1.4.2 超聲提取法 精密稱(chēng)取辣蓼樣品10.0 g置于具塞錐形瓶中，加入200.0 mL 60%乙醇，浸泡2 h，80 ℃超聲處理30 min，離心，濾渣繼續(xù)加200.0 mL 60%乙醇，超聲30 min，離心，合并兩次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至100 mL(生藥濃度0.1 g/mL)。

1.4.3 加熱回流提取法 精密稱(chēng)取辣蓼樣品10.0 g置于500 mL圓底燒瓶中，精密加入200.0 mL 60%乙醇，88℃水浴加熱回流4 h，離心，濾渣繼續(xù)加200.0 mL 60%乙醇，回流4 h，離心，合并兩次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至100 mL(生藥濃度0.1 g/mL)。

1.4.4 索氏提取法 精密稱(chēng)取辣蓼樣品10.0 g于500 mL索氏回流管中，加入200.0 mL 60%乙醇，88℃水浴加熱回流4 h，離心，濾渣繼續(xù)加200.0 mL 60%乙醇，回流4 h，離心，合并兩次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至100 mL(生藥濃度0.1 g/mL)。

1.5 提取工藝的優(yōu)化 以辣蓼總黃酮含量為考察指標(biāo)，選擇乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間及提取溫度作為考察超聲提取法的四個(gè)影響因素，按4因素3水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 辣蓼總黃酮提取工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平Tab 1 The orthogonal experiment factor level of extraction of total Flavonoids from Polygonum hydropiper

1.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照最佳工藝條件乙醇濃度60%，料液比1∶30，超聲提取時(shí)間50 min，超聲提取溫度80℃，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 總黃酮測(cè)定方法建立

2.1.1 線性關(guān)系考察

2.1.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 由蘆丁和樣品的光譜圖可知，在波長(zhǎng)為345 nm、510 nm處，溶液的吸光度達(dá)到兩個(gè)峰值，考慮到許多物質(zhì)(溶劑等非黃酮類(lèi)物質(zhì))在345 nm左右均有吸收，雜質(zhì)干擾較大，故選擇510 nm作為最大吸收波長(zhǎng)。蘆丁、供試品經(jīng)顯色后吸收曲線如圖1、2。

2.1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，回歸方程為 y=12.003x+0.0037，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。

圖1 蘆丁顯色后吸收光譜圖Fig 1 Absorption spectra of Rutin after coloration

圖2 辣蓼供試品顯色后吸收光譜圖Fig 2 Absorption spectra of Polygonum hydropiper after coloration

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 3 Standard Curves of Rutin

2.1.2 方法學(xué)考察

2.1.2.1 精密度試驗(yàn) 日內(nèi)精密度:同一條件下測(cè)定6次吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得總黃酮濃度，計(jì)算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD。日內(nèi)RSD=1.01%，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1.2.2 日間精密度 平行操作3份，測(cè)定吸光度，同法連續(xù)操作3 d，計(jì)算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD。日間RSD=0.58%，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 日內(nèi)精密性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The result of within－day precision test

表3 日間精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 The result of intraday precision test

2.1.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于 0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定的吸光度值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD。結(jié)果顯示顯色后的供試品在40 min內(nèi)是穩(wěn)定的，超過(guò) 40 min后，RSD＞2.0%，吸光度明顯降低，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 The result of stability test

2.1.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 平行操作6份，分別測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算總黃酮含量的變異系數(shù)RSD。結(jié)果見(jiàn)表5，RSD為1.45%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 The result of reproducibility test

2.1.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 低濃度組、中濃度組和高濃度組分別顯色后測(cè)定其吸光度，計(jì)算加標(biāo)回收率及相應(yīng)的RSD值。結(jié)果見(jiàn)表6，以蘆丁為對(duì)照品，檢測(cè)樣品的平均回收率，RSD＜2%(n=3)，均符合要求。

表6 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab 6 The result of recovery test

2.2 提取方法的篩選 不同提取方法的總黃酮含量總黃酮含量結(jié)果詳見(jiàn)表7，提取率從大到小依次為:超聲提取法＞加熱回流提取法＞索氏提取法＞熱水提取法，超聲提取法與加熱回流提取法總黃酮得率相差不大，但加熱回流提取時(shí)間長(zhǎng)，能耗較大，所以本研究選用超聲提取法。

2.3 提取工藝的優(yōu)化 正交試驗(yàn)中各因素和水平之間的9種組合方式及每組結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，最佳提取工藝條件組合為:A2B3C3D3，考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本，可選擇A2B2C3D3即乙醇濃度為60%，料液比為1∶30，超聲提取時(shí)間為50 min，超聲提取溫度為80℃。由RB＞RA＞RD＞RC得其因素影響順序?yàn)榱弦罕龋疽掖紳舛龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照最佳工藝條件乙醇濃度60%，料液比1∶30，超聲提取時(shí)間50 min，超聲提取溫度80℃，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。從表9可看出，最佳提取工藝條件下RSD為0.68%，具有較好的重復(fù)性。

表7 辣蓼不同提取方法的總黃酮含量(單位:mg/g)Tab 7 The total flavonoid content of four kinds of method(unit:mg/g)

表8 辣蓼超聲提取法正交實(shí)驗(yàn)k(34)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab 8 Design and result of orthogonal experiment of ultrasonic extraction

表9 辣蓼提取工藝最佳條件驗(yàn)證(單位:mg/g)Tab 9 The result of verifying test(unit:mg/g)

3 討論與結(jié)論

根據(jù)設(shè)備與操作方式不同，總黃酮的提取方法可分為:滲漉法、浸漬法、索氏提取法、加熱回流提取法等，不同操作方法各有優(yōu)劣［11－14］。辣蓼中總黃酮的不同提取方法也有很多文獻(xiàn)報(bào)道，羅文涓［15］等采用浸提法、水煎醇沉法、超聲法、超聲酶解法(加纖維素酶)、超聲酶解法(加果膠酶)和超聲配合酶解法進(jìn)行辣蓼總黃酮的提取，結(jié)果表明，超聲法能耗低、得率高，所得的黃酮種類(lèi)多于浸提法與水煎醇沉法。利用超聲提取配合酶解法對(duì)辣蓼總黃酮進(jìn)行提取，得到的黃酮母體結(jié)構(gòu)具有多樣性，因此，采用超聲提取配合酶解法獲得的辣蓼總黃酮得率最高。

實(shí)驗(yàn)采用熱水提取法、超聲提取法、乙醇加熱回流法、索氏提取法分別對(duì)辣蓼總黃酮進(jìn)行提取，最終總黃酮含量從大到小依次為超聲提取法(52.90 mg/g)＞加熱回流提取法(50.97 mg/g)＞索氏提取法(41.80 mg/g)＞熱水提取法(17.97 mg/g)。其中熱水提取法為最傳統(tǒng)的水煎煮法，不借助任何儀器，也無(wú)需添加任何溶劑，因此提取率最低;超聲提取法為超聲輔助醇提法，無(wú)論是有效物質(zhì)的釋放，還是釋放后的溶解性都比水煎煮法要顯著高出很多;而加熱回流法和索氏提取法都是借用不同裝置和處理進(jìn)行的醇提法，提取總黃酮含量比超聲提取法略低。熱水提取法操作簡(jiǎn)便，試劑廉價(jià)易得，但提取率太低;索氏提取法無(wú)論在提取率方面還是節(jié)約資源方面都并不理想;加熱回流提取法與超聲提取法總黃酮得率相差不大，但加熱回流法兩次提取共耗時(shí)超過(guò)8 h，且能耗大，超聲提取大大縮短了提取時(shí)間(只需1 h)，提取充分，能耗低，操作方便，是較為理想的提取辣蓼總黃酮的方法，所以本次研究最終選用超聲提取法進(jìn)行優(yōu)化。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示因素影響順序?yàn)榱弦罕龋疽掖紳舛龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間，乙醇濃度為60%，料液比為1∶30，超聲提取時(shí)間為50 min，超聲提取溫度為80℃時(shí)，總黃酮提取濃度最高，為53.3 mg/g。這與張晶［16］等人利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出的超聲波輔助提取辣蓼中總黃酮條件略有不同，但與其可提取到的黃酮類(lèi)化合物含量(55.8 mg/g)相差不大，這可能是因?yàn)椴煌a(chǎn)地的辣蓼對(duì)不同條件的適應(yīng)性不一樣，但超聲處理均可有助于辣蓼中總黃酮的釋放和提取。