加味麻杏石甘湯對EMT過程中ERK/GSK3β/snail信號通路的調控作用探討

王媛媛 吳旭萍 林勝友*

放射性肺損傷主要包括放射性肺炎和放射性肺纖維化兩個階段。肌成纖維細胞在放射性肺纖維化過程中起重要作用，上皮間質轉化（EMT）過程為組織纖維形成過程中的中介過程［1-2］。其特征在于上皮蛋白如E-鈣粘蛋白（E-cadherin）和蛋白質的缺失，從而獲得新的間質標志物，包括波形蛋白（Vimentin）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），而下調E-鈣粘蛋白表達可通過轉錄實現抑制，包括snail蛋白［3］。ERK/GSK3β/snail通路是新近發現的放射性肺纖維化相關EMT的重要信號調控通路［4］，而GSK3β/snail復合體能被上游磷酸化的ERK解離，snail被釋放，恢復活性。沉默大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞ERK基因，能夠減弱GSK3β復合物的解離，從而減少有活性的snail，調控EMT過程。本文探討EMT過程中加味麻杏石甘湯對ERK/GSK3β/snail信號通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞 清潔級SD大鼠18只，體重約200～250g，雌雄各半，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（瀘）2013-0016。小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞由上海中科院提供。

1.2 中藥含藥血清的制備 加味麻杏石甘湯水煎劑組方：炙麻黃9g、石膏18g、杏仁12g、銀花9g、甘草6g 等組成，委托浙江中醫藥大學藥學院采購并制備，濃縮為含生藥2.44g/ml的中藥藥液。分裝于等量真空中藥袋中，4℃保存，備用。含藥血清的制備：將18只清潔級大鼠隨機分為2組，正常對照組6只，中藥組12只。正常對照組給予生理鹽水灌胃，中藥組給予中藥制劑灌胃。中藥組大鼠按19.5g/d（4ml）中藥給予灌胃（相當于成人劑量的15倍），用于制備含藥血清。2次/d，連續給藥3d，末次給藥2h后采血。3d后以10%水合氯醛腹腔麻醉，在腹主動脈取血，分別制備血清，滅活、過濾除菌、分管，同組血清混合，分裝至1ml離心管中，-20℃凍存，4周使用，避免反復凍融。

1.3 試劑及儀器 主要試劑：ERK抑制劑：U0126（S1102，Selleck）；P-GSK3β（Ab75745，abcam 公司）；E-cadherin（#14472）、Vimentin（#5741）、α-SMA（#19245）、ERK（#9102）、P-ERK（#9101）、Snail（#3879）、GSK3β（#12456）、GAPDH（#5174） 均購自CST公司。主要儀器：細胞培養耗材（TR4001、TR4002、TR5000，TRUELINE）；透射電子顯微鏡（1230，JEM）；激光共聚焦顯微鏡（fv1000，奧林巴斯）。

1.4 細胞模型的建立 采用總劑量5Gy，3.64Gy/min將小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞進行放射線照射，建立模型［5］。

1.5 分組 實驗分為5組：正常大鼠血清組（使用含6%正常大鼠血清配置的完全培養基培養細胞；模型+正常大鼠血清組（細胞照射后使用含6%正常大鼠血清配置的完全培養基培養細胞）；模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組（細胞照射后使用含6%正常大鼠血清配置的完全培養基培養24h后，并加入10μM U0126處理細胞24h）；模型+含藥大鼠血清組（細胞照射后使用含6%含藥大鼠血清清配置的完全培養基培養）；模型+含藥大鼠血清+ERK抑制劑組（細胞照射后使用含6%含藥大鼠血清配置的完全培養基培養24h后，并加入10μM U0126處理細胞24h）。

1.6 觀察指標 Western blot檢測細胞表型蛋白及信號通路主要蛋白；激光共聚焦顯微鏡觀測snail轉核。

1.7 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料采用（±s）表示，兩組間比較用t檢驗，多個樣本均數間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Western blot檢測細胞表型蛋白及信號通路主要蛋白比較 （1）小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞snail水平：與正常血清組比較，模型+大鼠血清組snail上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清組比較，模型+正常大鼠血清+siNC組差異無統計學意義（P＞0.05），模型+含藥血清組、模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組、模型+含藥血清+ERK抑制劑組，snail濃度明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組比較，模型+含藥血清+ERK抑制劑組snail濃度下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。（2）小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞E-cadherin水平：與正常血清組比較，模型+大鼠血清組E-cadherin濃度降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清組比較，模型+正常大鼠血清+siNC組差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組比較，模型+含藥血清+ERK抑制劑組E-cadherin濃度升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。（3）小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞p-GSK-3β水平：與正常血清組比較，模型+大鼠血清組p-GSK-3β上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清組比較，模型+正常大鼠血清+siNC組差異無統計學意義（P＞0.05），模型+含藥血清組、模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組、模型+含藥血清+ERK抑制劑組，p-GSK-3β濃度下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組比較，模型+含藥血清+ERK抑制劑組p-GSK-3β下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。（4）小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞p-ERK水平：與正常血清組比較，模型+大鼠血清組p-ERK上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清組比較，模型+正常大鼠血清+siNC組差異無統計學意義（P＞0.05），模型+含藥血清組、模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組、模型+含藥血清+ERK抑制劑組，p-ERK濃度明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型+正常大鼠血清+ERK抑制劑組比較，模型+含藥血清+ERK抑制劑組ERK濃度稍降低，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表1。

圖1 Western blot檢測細胞表型蛋白及信號通路主要蛋白

表1 Western blot檢測細胞表型蛋白及信號通路主要蛋白灰度值（±s）

表1 Western blot檢測細胞表型蛋白及信號通路主要蛋白灰度值（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

snail E-cadherin p-GSK-3β p-ERK空白對照組 1.00±0.38 1.00±0.02 1.00±0.13 1.00±0.23模型對照組 3.22±0.27* 0.28±0.12* 2.65±0.22* 2.78±0.29*模型+正常血清+ERK抑制劑組 2.56±0.38△ 0.54±0.08△ 2.08±0.16△△ 2.14±0.21△△模型+含藥血清組 1.16±0.16△ 0.38±0.06△ 1.22±0.20△△ 1.69±0.14△△模型+含藥血清+ERK抑制劑組 1.83±0.20△△ 0.76±0.10△△ 1.98±0.10△△ 2.02±0.18△△

2.2 激光共聚焦顯微鏡觀測snail轉核 激光共聚焦觀察snail轉核結果顯示，模型組與空白對照組比較，snail明顯增加。含藥血清組與模型組比較，snail減少，加入ERK抑制劑及沉默TGF-β基因后，snail表達減少。

3 討論

放射性肺損傷的發生發展過程復雜，包含一系列細胞和分子的變化，其機制包括肺泡上皮細胞和肺泡巨噬細胞損傷，肺組織分泌大量的炎性細胞因子、趨化因子和生長因子，吸引更多的炎性細胞聚集，而炎性損傷部位周圍有促纖維細胞因子表達和成纖維細胞增殖分化，形成肺纖維化［6-8］。

中醫認為，放射線屬于熱邪，首犯肺臟，肺為嬌臟，感受火邪，耗氣傷陰，煉液成痰，灼血成瘀，致肺燥陰傷、瘀血內阻，結合研究放射性肺纖維化熱毒壅盛-氣陰虧虛-痰瘀互結的病機演變過程，放射性肺纖維化治療多以清熱解毒、養陰生津、化痰祛瘀法為指導思想［9］。麻杏石甘湯出自《傷寒論》，方中用麻黃宣肺，石膏清肺，杏仁降利肺氣，甘草益氣和中，以達辛涼解表、清肺平喘功效，前期有研究采用麻杏石甘湯為基礎，加桑白皮、金銀花等組成加味麻杏石甘湯能夠明顯減輕放射性炎性損傷［10］。

在EMT過程中，上皮細胞逐漸失去極性并獲得間充質，具有增強遷移潛力的特征，α-SMA、間質蛋白被釋放對肌成纖維細胞活化的反應并給予強烈的反應收縮性能［11］。E-cadherin是一種上皮標記物，主要參與細胞間相互作用的維持，保持細胞的結構完整性［12］。Snail是一個E-cadherin的調節劑，幫助上皮細胞發育，進入成纖維細胞樣遷移間充質細胞［13］。糖原合成酶激酶 3β（GSK-3β）可以通過與snail形成復合體，維持上皮細胞形態，促進其蛋白酶的降解來抑制 Snail的表達水平［14］。GSK3β 可被包括 PI3K/AKT［15］和 ERK1/2 MAPK［16］在內的多種信號轉導通路滅活，從而上調Snail的表達水平，誘導 EMT。有研究顯示ERK可磷酸化滅活GSK3β（Ser9 位點）［17］，snail被釋放，恢復活性。在本實驗中，為了確定ERK軸信號是否影響GSK3β磷酸化，從而選擇ERK抑制劑U0126。結果發現，蛋白質印跡和免疫熒光分析顯示輻射增加GSK3β（S9）的磷酸化并被刺激細胞中的snail核移位。數據表明輻射增強GSK3β磷酸化絲氨酸9活性部位，導致其與snail分離，從而促進snail的核移植。

加味麻杏石甘湯減弱輻射誘導的磷酸化GSK3β和改變細胞中Snail，α-SMA和E-鈣粘蛋白的蛋白水平（P＜0.05），EMT抑制劑作用于模型+正常血清組后GSK-3β、snail濃度明顯下降（P＜0.05），加入ERK抑制劑的含藥血清作用后，GSK-3β、snail仍較加入抑制劑的正常血清組有所下降（P＜0.05），且ERK濃度差異無統計學意義，這可能與中藥多靶點調控多種信號通路有關，即加味麻杏石甘湯也有可能通過其他途徑調控GSK-3β/snail通路，需要進一步研究。