可逆加成-斷裂鏈轉移沉淀聚合法制備木犀草素分子印跡聚合物及其表征

蘇立強， 楚善明， 謝 鵬， 王媛媛

(齊齊哈爾大學化學與化學工程學院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

木犀草素(Luteolin，LTL)為一種典型的黃酮類化合物，是多種常見中草藥和天然產物中的有效成分之一，因其可調節人體免疫功能以及良好的抗病毒性能，在醫藥方面有重要的應用價值。因合成藥物產率低，且具有一定毒副作用，近年來人們更傾向于從植物中提取具有藥用價值的化學成分[1 - 3]。目前，木犀草素提取的方法主要有:乙醇-水溶劑提取法、堿性稀醇提取法、超聲波法、超臨界流體萃取法、酶提取法和大孔樹脂吸附法。但這些方法都不同程度存在有機溶劑消耗大，純度低等問題。因此，針對合成以及提取的諸多弊端，建立高選擇性的提取木犀草素的方法具有重要意義。

分子印跡技術(MIT)是指制備對某一特定目標分子具有特異選擇性聚合物的過程。在分子識別、固相萃取、色譜分離等方面得到廣泛應用。分子印跡聚合物(MIPs)的制備方法主要有本體聚合、懸浮聚合、沉淀聚合、表面聚合、原位聚合等。可逆加成-斷裂鏈轉移(RAFT)-沉淀聚合法具有單體適用范圍廣、聚合過程簡單、特異性吸附量大等優點[4 - 6]，同時又避免了傳統沉淀聚合因自由基反應過程不受控制，使得所制備的MIPs粒徑范圍較寬，內部孔穴差異較大的缺點[7 - 9]。目前對木犀草素MIPs的制備大都采用傳統聚合方法[16 - 20]。祁楚楚等[19]以木犀草素為模板分子，利用本體聚合法制備MIPs；曹紅梅[20]以懸浮聚合法制備了木犀草素MIPs。本文采用RAFT-沉淀聚合法制備木犀草素MIPs，其吸附性能優于傳統方法制備的聚合物，將其作為固相萃取材料，用于花生殼中木犀草素的分離富集，效果良好。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

P230型高效液相色譜儀(大連依利特公司)。

木犀草素(LTL)、香葉木素、芹菜素、丙烯酰胺(AM)(分析純，天津科密歐化學試劑開發中心)，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(分析純，東京化成工業株式會社)，偶氮二異丁腈(AIBN)(分析純，天津光復精細化工研究所)，二硫化碳、無水NaSO4、四正丁基溴化銨、石油醚、甲醇、氯化芐均為分析純(Sigma試劑有限公司)，甲酸為優級純(天津市科密歐化學試劑中心)。

1.2 鏈轉移試劑二芐基三硫代碳酸酯的制備

參照文獻方法[10]制備鏈轉移試劑二芐基三硫代碳酸酯(DBTTC)，并用紅外光譜法進行表征。

1.3 分子印跡聚合物的制備

在100 mL圓底燒瓶中加入0.0715 g (0.25 mmol)模板分子LTL，0.0718 g (1 mmol)功能單體AM，超聲溶解于40 mL甲醇中，預聚合8 h。再加入2.765 g (14 mmol)交聯劑EGDMA，0.01 g 引發劑AIBN和0.05 g DBTTC，超聲15 min，緩慢通入N2脫氧15 min，將圓底燒瓶密封后，置于60 ℃恒溫水浴中熱聚合24 h。用10%乙酸-甲醇溶液(V/V)對聚合物進行索氏提取24 h，以去除模板分子和未參加反應的功能單體及交聯劑。再除去殘留的乙酸，45 ℃真空干燥48 h，即得R-MIPs。除不加模板分子外，其他操作步驟同上，制備非印跡聚合物R-NIPs。不加入DBTTC，其他同上，制備傳統印跡聚合物T-MIPs和非印跡聚合物T-NIPs。

1.4 MIPs吸附性能研究

1.4.1靜態吸附實驗配制濃度(c0)范圍在0.00～100.00 μg/mL的木犀草素溶液，再分別向各溶液中加入10 mg的MIPs，靜止12 h。然后取上層清液1 mL，用0.45 μm膜過濾后，加無水甲醇稀釋至3 mL，利用紫外分光光度計測得各溶液的濃度ce，根據吸附前后木犀草素的濃度變化，計算洗脫后的MIPs的吸附量，然后按照公式：Q=(c0-ce)×V/m計算得出分子印跡聚合物對木犀草素(LTL)的飽和吸附容量Q。

1.4.2動態吸附實驗稱取0.0300 g MIPs，置于100 mL錐形瓶中，加入35 mL 100 μg/mL的木犀草素溶液，再加入15 mL無水甲醇，低頻超聲10 min。每間隔20 min吸取1 mL上層清液，離心5 min(800 r/min)，用0.45 μm膜過濾后，利用紫外分光光度計測得相應濃度ce，根據公式計算MIPs的吸附容量Q。

1.4.3選擇性吸附實驗取吸附瓶三個，分別加入10 mL濃度為100 μg/mL的木犀草素溶液、芹菜素溶液、香葉木素溶液，各加入MIPs 10 mg，超聲10 min后，置于25 ℃室溫下靜止12 h。利用紫外分光光度計測得相應的吸光度，通過標準曲線得出濃度ce，根據公式分別計算MIPs的吸附容量Q。用相同的方法進行R-NIPs的選擇性吸附實驗。

1.5 樣品處理與固相萃取

取粉碎花生殼5 g溶解于200 mL 50%甲醇中，超聲提取0.5 h，回流提取3次，將三次提取的甲醇溶液合并后過濾，再將濾液蒸發濃縮，離心5 min，取上清液用50%甲醇定容至250 mL。分子印跡固相萃取(MISPE)柱依次用3 mL水和5 mL甲醇活化，取已處理好的甲醇溶液上樣，然后用3 mL乙腈淋洗，再用10 mL甲醇/乙酸(9∶1，V/V)作為洗脫液進行洗脫，將洗脫液濃縮至1 mL。濃縮液經高效液相色譜法(HPLC)檢測。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm,1.7 μm)；流動相:甲醇；紫外檢測波長：348 nm；流速：0.5 mL/min。

2 結果與討論

2.1 木犀草素印跡機理

木犀草素是一種多酚化合物，在預聚合中酚羥基上的H+與功能單體(AM)上的O原子發生強烈的氫鍵作用。加入交聯劑、引發劑和RAFT試劑后，在60 ℃下反應，生成聚合物，洗脫除去模板分子后，在聚合物內部形成與模板分子結構、大小相匹配的孔穴，可以特異選擇性吸附模板分子。在該分子印跡聚合物的末端，含有RAFT試劑，在相同的實驗條件時，可以繼續引發反應。

木犀草素分子內部含有四個酚羥基，從理論上講功能單體與模板分子將以1∶4的比例形成配合物，在印跡孔穴中含有四個結合位點，依靠“四點作用”方式實現對模板分子的識別。酚羥基是氫鍵的良好供體，丙烯酰胺中的-NH2基與C=O基團均可作為氫鍵受體，-NH2中N上的孤對電子與相鄰的C=O基團會產生共軛，與木犀草素中的酚羥基形成穩定的氫鍵。

2.2 R-MIPs與T-MIPs的掃描電鏡圖對比

采用傳統沉淀聚合法與RAFT-沉淀聚合法分別制備木犀草素MIPs，對比其形貌上的差異，掃描電鏡圖見圖1。傳統方法合成的聚合物有粘連現象，粒徑較小，且粒分布不均勻。加入RAFT試劑后，聚合物大小均一，粒徑明顯增大，大約為3.5 μm，更適合作為固相萃取填料。這是因為聚合過程中RAFT試劑的存在會導致活性種(生長鏈)和休眠種(RAFT基團鏈)之間能夠形成快速的動力學平衡，從而使聚合速度可控。

圖1 T-MIPs(A)與R-MIPs(B)的掃描電鏡(SEM)圖(5 μm)Fig.1 SEM images of T-MIPs(A) and R-MIPs(B) (5μm)

2.3 靜態吸附性能

采用靜態吸附實驗考察聚合物吸附性能，繪制出R-MIPs、R-NIPs、T-MIPs、T-NIPs的靜態吸附曲線，見圖2。由圖2可知，R-MIPs和T-MIPs的吸附容量明顯高于R-NIPs和T-NIPs。這是因為MIPs內部存在與LTL結構相匹配的印跡孔穴，且孔穴內規則排列著與其結構相應的結合位點，吸附容量較大；而NIPs內部不存在這樣的孔穴，主要依靠物理吸附，吸附容量較小。另外，R-MIPs的吸附容量(32.60 mg/g)高于T-MIPs的吸附容量(29.06 mg/g)，這是因為在RAFT-沉淀聚合過程中引入DBTTC，抑制了自由基無序反應，穩定了增長自由基濃度，從而控制了反應進程，使粒徑更加均勻有序，吸附容量更大。R-NIPs 的吸附容量(14.41 mg/g)低于T-NIPs的吸附容量(16.61 mg/g)是因為引入DBTTC后，聚合物粒徑變大，表面積減小，使其物理吸附量變小。

2.4 動態吸附性能

為考察R-MIPs對模板分子的結合速率，進行動力學吸附實驗。考察聚合物與模板分子結合的動力學性能。動力學吸附曲線如圖3，吸附在2 h快速達到平衡，主要是由于RAFT-沉淀法制備的聚合物孔穴更均勻，表面更光滑，快速的吸附平衡可更好的應用于實際。

圖2 R-MIPs、T-MIPs、T-NIPs和R-NIPs的吸附等溫線Fig.2 Adsorption isotherm of R-MIPs,T-MIPs,T-NIPs and R-NIPs

圖3 R-MIPs的動力學吸附曲線Fig.3 Kinetic adsorption curve of R-MIPs

對聚合物的動力學數據進行準一級動力學模型和準二級動力學模型擬合[12]，見表1。準一級動力學模型公式為:ln(Qe-Qt)=lnQ1-K1t；準二級動力學模型公式為:t/Qt=1/(K2Q22)+t/Q2。式中，Qt為t時刻的吸附容量(mg/g)；Qe為達到平衡時的吸附容量(mg/g)；K1，K2分別為一級和二級動力學速率常數(h-1)。

表1 聚合物準一級和準二級動力學模型參數

準一級動力學模型主要描述物理吸附，準二級動力學模型主要描述化學吸附，包含了吸附的所有過程(外部液膜擴散、表面吸附和顆粒內擴散等)。通過比較準一級動力學模型和準二級動力學模型的相關系數R2，可知R-NIPs對LTL的吸附過程更符合準一級動力學模型，屬于物理吸附，R-MIPs對LTL的吸附過程更符合準二級動力學模型，屬于化學吸附。說明其吸附過程受化學吸附機理的控制，這種化學吸附涉及到吸附劑與吸附質之間的電子共用或電子轉移，即LTL的羥基與功能單體AM的羰基之間存在電荷轉移。

圖4 R-MIPs與R-NIPs對三種底物的選擇性吸附Fig.4 Selective adsorption of R-MIPs and R-NIPs on three kinds of substrates

2.5 吸附選擇性

為考察MIPs對模板分子的選擇性能，選用與木犀草素結構類似的香葉木素和芹菜素為對照物，測定聚合物對三者的吸附容量，實驗結果見圖4。由圖可知，R-MIPs對木犀草素的吸附容量遠大于對香葉木素(Diosmetin)和芹菜素(Apigenin)的吸附容量，這是由于在R-MIPs中有與木犀草素結構相匹配的印跡孔穴，這個印跡孔穴與其他兩種物質的結構不匹配，而R-NIPs對三種物質的吸附容量無明顯差別，這是因為R-NIPs中沒有與模板分子相匹配印跡孔穴，所以在吸附容量上差別很小。

圖5 花生殼在固相萃取前后的色譜圖Fig.5 Chromatograms of peanut shell before and after solid phase extraction

2.6 花生殼中木犀草素的提取

以R-MIPs作為固相萃取填料制備MISPE柱，將MISPE與HPLC法相結合，用于花生殼中木犀草素的富集與檢測。在花生殼中檢測出木犀草素，經過測定其含量為5.69 mg/g，色譜圖見圖5，經過MISPE處理后有效地去除了基質雜質，得到較好的富集分離效果，表明該印跡材料可用于對復雜樣品中木犀草素的分離純化。

3 結論

采用RAFT-沉淀聚合法制備了木犀草素分子印跡聚合物(R-MIPs)，并利用掃描電鏡進行了表征。靜態吸附實驗表明，R-MIPs對LTL具有較大吸附容量，飽和吸附容量達到32.6 mg/g。以R-MIPs作為固相萃取填料對花生殼中木犀草素進行分離富集，能有效去除基質雜質，該印跡聚合物表現出對LTL優異的分離富集效果，為工業生產中LTL的分離提純提供了一種可能的途徑。