改良QuEChERS/超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測蔬菜中14種喹諾酮類抗生素殘留

劉 暢

(哈爾濱市農產品質量安全檢驗檢測中心，黑龍江哈爾濱 150000)

喹諾酮類又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是一類合成抗菌藥，主要作用于革蘭陰性菌[1]。由于其具有價格低廉、高效低毒、抗菌廣譜等優點，被廣泛應用于防治動物疫病、提高養殖效益、保障公共衛生安全等方面。但是近年來，獸藥抗生素的濫用以及國內一些蔬菜產區的抗生素超標情況多有報道[2 - 4]。蔬菜生長環境中的土壤、灌溉水、地下水、作為農田有機肥的動物糞便中均存在抗生素檢出甚至是超標的情況[5 - 7]。段曉潔[8]的研究表明，生長環境中的抗生素會在植物體內遷移；葉菜對喹諾酮類抗生素的富集程度要比根莖類高；受污染的小白菜不同部位的喹諾酮類抗生素含量差異明顯，依次為葉>根>莖。

目前，在受污染環境中收獲的蔬菜的安全情況得不到根本保證，所以建立一種檢測蔬菜中抗生素多殘留的方法尤為重要。吳小蓮等[9]使用固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法檢測蔬菜中4種喹諾酮類抗生素的殘留，但該方法操作復雜，成本高，需要操作人員接觸過多有機試劑，不適合大批量樣品的同時檢測。QuEChERS方法具有回收率高、操作簡單等眾多優點，并在動物源性食品中的抗生素殘留檢測中也有較多應用[10 - 11]。傳統QuEChERS方法使用MgSO4和NaAc作為萃取鹽，使用乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)作為凈化試劑，考慮到喹諾酮藥物結構中的官能團會與這些萃取鹽發生反應，以及在凈化過程中除去多余水分，保證PSA凈化效果達到最佳這兩個因素，本文將QuEChERS前處理方法加以改良，選擇了新的萃取鹽和凈化試劑，適用于蔬菜中喹諾酮類抗生素多殘留的提取，結合超高效液相色譜-串聯質譜法檢測，為蔬菜中喹諾酮類抗生素多殘留的定量分析和安全風險評估提供依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY TQD超高效液相色譜-串聯質譜儀(美國，Waters)；MS3渦旋振蕩器(德國，IKA)；3K15高速冷凍離心機(美國，SIGMA)；MULTIVAP-30位氮吹儀(美國，Organomation)；梅特勒ME204分析天平(感量0.0001 g)；Milli-Q高純水發生器(美國，Millipore)；梅特勒PL4002電子天平(感量0.01 g)。

近年來，青海省借助與西亞、中亞等國家的地緣優勢和文化優勢，加快了民族服飾制作、清真食品加工、藏毯藏藥生產等企業“走出去”的步伐。“哈薩克斯坦——中國商品展覽會”、“名優商品推介會”等活動的舉辦增強了青海特色優勢產業與“一帶一路”沿線國家的貿易往來。憑借著在開發電力、制作建材等領域上的技術優勢，青海在東南亞等國家先后開展了境外工業園區建設和資源基地開發等項目。

諾氟沙星(NOR)、環丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、依諾沙星(ENO)、培氟沙星(PEF)、氧氟沙星(OFL)、氟羅沙星(FLX)、洛美沙星(LOM)、奧比沙星(ORB)、沙拉沙星(SAR)、雙氟沙星(DIF)、司帕沙星(SPA)、惡喹酸(OA)、氟甲喹(FLU)、諾氟沙星-d5、恩諾沙星-d5、環丙沙星-d8，純度均≥99.0%(德國Dr Ehrenstofer)；HAc(分析純，常州通誠化工有限公司)；乙腈(優級純，山東紫翔化工有限公司)；無水Na2SO4(優級純，沈陽寧軒化工有限公司)；乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific)；甲酸(色譜純，美國Sigma-Aldrich)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(色譜純，天津博納艾杰爾)。

1.2.2液相色譜分析條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm,1.7 μm)，柱溫：40 ℃。流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液，流速：0.30 mL/min，進樣體積：5.0 μL。梯度洗脫程序：0～2 min，10%～25%A；2～3 min，25%～45%A；3～4 min，45%～90%A；4～5.5 min，90%A；5.5～5.6 min，90%～10%A。

1.2 實驗條件

1.2.1樣品前處理準確稱取黃瓜樣品10.00 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，加入1%乙酸乙腈10 mL，再加入10 g無水Na2SO4，立即渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min。提取上清液8 mL于裝有150 mg PSA和1 g無水Na2SO4的凈化管中，用力搖勻凈化管30 s，8 000 r/min離心5 min。吸取經過凈化的液體5 mL于40 ℃下氮氣吹干。殘渣用200 μL乙腈、800 μL水溶解，0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜-質譜質測定。

1.2.3質譜分析條件多反應監測模式(MRM)；電噴霧離子源(ESI+)，離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣流速750 L/h；脫溶劑氣溫度400 ℃；毛細管電壓3.0 kV；錐孔氣速50 L/h。14種喹諾酮類抗生素定性定量離子對及對應碰撞氣能量見表1。

近些年，隨著國家大力倡導低碳經濟發展模式，碳會計信息披露得到了更多企業的重視，但在具體披露過程中，無論是資金技術實力強大的500強企業還是中小型上市公司，都面臨著披露內容規范性、披露主體重視性、法律制度完善性以及理論知識實用性等諸多方面的挑戰。

當今世界，不同的國家面臨著不同的國情。即使在同一國家乃至同一地區，也會呈現出民族、文化、每個人所處的具體社會地位的多樣性，由此也引發了利益分歧的多樣性，尤其是價值觀念的多樣性。而價值觀，是以一定文化的內核乃至核心的形式呈現出來的。在此意義上，這種多樣性的價值觀念，為各個國家和地區開展協商民主、達致多元共識提供了重要的文化條件。這也正如當代美國協商民主研究領域的知名學者詹姆斯·博曼所言:“多樣性甚至能夠促進理性的公共運用，并使民主生活更加充滿活力。”這一觀點，不僅揭示了價值觀念的多樣性同民主特別是協商民主之間的內在聯系，也表征了西方學界對于二者關系具有代表性的認知。

表1 14種喹諾酮類抗生素定性定量離子對及對應碰撞氣能量

*Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 提取條件的選擇

實驗比較了不同種類和用量的凈化劑對待測物回收率的影響，以獲得最優的凈化條件。在農產品分析中，PSA經常被用于去除基質中的一些干擾物質，如碳水化合物、脂肪酸、有機酸、酚類、色素等。為了避免多余水分影響PSA的凈化效果，這一步還需增加除水劑以確保凈化效果。對于色素干擾不嚴重的基質如黃瓜等，分別設計PSA+Na2SO4(50 mg+1 g)；PSA+Na2SO4(150 mg+1 g)；PSA+Na2SO4(250 mg+1 g)；PSA+Na2SO4(150 mg+500 mg)；PSA+Na2SO4(150 mg+1.5 g) 5組試驗來考察PSA和無水NaSO4的最佳用量。在添加濃度為30 μg/kg水平下，選取PSA+Na2SO4(150 mg+1 g)為凈化劑的一組，喹諾酮的回收率在73.8%～114.3%范圍內且重復性好；其他組喹諾酮的回收率數值相差較大，甚至依諾沙星、司帕沙星沒有回收，所以選擇PSA+Na2SO4(150 mg+1 g)為凈化劑。對于色素干擾嚴重的基質，可添加適量石墨化碳黑(GCB)排除色素干擾，但由于GCB對于平面結構的藥物吸附作用極強，為保證回收率添加量宜少不宜多。以白菜為例，GCB的添加量在60 mg時，14種獸藥的回收率基本能夠保持在較好范圍內。

傳統的QuEChERS方法使用MgSO4和NaAc作為萃取鹽，使目標物進入有機相。在本實驗中使用這兩種萃取鹽后，14種喹諾酮中有8種沒有回收，其余幾種回收率也僅在40%左右。這可能是由于喹諾酮分子結構中的3-羧基和4-羰基可與Mg2+等金屬離子螯合[13]，進而造成了目標物回收率低。改用中性的不與目標物發生反應且吸水量更大的無水Na2SO4作為萃取鹽，得到了較好的回收率。對于黃瓜這種含水量較高的蔬菜無水Na2SO4的用量要達到10 g才能充分吸收水分，為后續使用PSA凈化創造良好條件；而對于含水量不如黃瓜的茄子等基質來說，為減少過多雜質干擾，無水Na2SO4的用量以6～8 g為宜。

1.2.2 排除標準 排除入組時根據病史采集情況，已經患有冠心病、心絞痛、心肌梗死、腦出血，腦梗死，腦栓塞的人群。

基質效應(ME)可以用提取后加標法定量測定空白基質提取液與純溶劑中同濃度分析物的離子響應強度的比值來評價，即ME=B/A。其中A表示目標物在空白基質溶液中的響應值，B表示目標物在純溶劑溶液中的響應值。如果ME>1，說明產生基質增強效應；ME<1，說明產生基質抑制效應；ME=1，說明不存在基質效應[14]。以黃瓜為基質，使用凈化試劑前后的基質效應變化情況見圖2。結果表明，14種喹諾酮類抗生素中只有3種呈現基質抑制效應，其余均表現為基質增強效應。在使用凈化劑后，大多數目標物的基質效應得到抑制。

2.2 凈化試劑的選擇

煙臺市通過大力實施生態建設工程，不斷加大環境保護力度，加強重點流域濕地建設，推動森林和濕地資源實現穩步增長。今年以來，煙臺市完成造林11.68萬畝，森林撫育20萬畝，濕地保護與修復7.6萬畝，生態環境持續改善。

圖1 不同濃度乙酸乙腈提取效果的比較Fig.1 The comparison of three different concentrations of acetic acid-acetonitriles in extraction efficiencies

圖2 凈化過程對14種抗生素基質效應的影響Fig.2 The influence purification process on the matrix effect of 14 antibiotics

喹諾酮是兩性化合物，在酸性環境下更容易提取。根據文獻報道[12]，本實驗選擇0.1%、1.0%、4.0% 3個濃度的乙酸乙腈作為提取液來考察目標物的提取效果。在添加濃度為30 μg/kg水平下，不同濃度的提取液對14種喹諾酮類化合物的提取情況見圖1。由圖1可知，使用0.1%乙酸乙腈作為提取液時，目標物提取率過低，數據波動范圍大，精確度差；使用1.0%乙酸乙腈作為提取液時，各目標物的提取率在較好的范圍內，平行數據波動不明顯、精確度良好；隨著乙酸濃度增加，有個別化合物的提取率達到120%以上，呈現出明顯的基質增強效應，且精確度最差。因此，選用1.0%乙酸乙腈作為提取液。

2.3 方法學評價

使用空白樣品的提取液，分別配制濃度為0,1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列標準溶液，氟羅沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星以諾氟沙星-d5為內標；洛美沙星、奧比沙星、雙氟沙星、環丙沙星以環丙沙星-d8為內標；恩諾沙星、沙拉沙星、司帕沙星、惡喹酸、氟甲喹以恩諾沙星-d5為內標，繪制標準曲線，14種目標物在1.0～100.0 μg/L范圍內線性關系良好，其線性方程和相關系數列于表2。用信號強度和噪聲的比值(S/N=3)計算檢出限(LOD)，以S/N=10時對應的含量為定量限(LOQ)(表2)。以黃瓜為基質，考察方法的準確度，在3個添加濃度下，14種喹諾酮類抗生素的回收率和相對標準偏差(RSD)具體數據見表2。

將本方法與已被報道的固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法[9]和分散液液微萃取-高效液相色譜法[15]進行對比，具體情況見表3。

表2 黃瓜中14種喹諾酮類抗生素的線性方程、相關系數、檢出限和定量限及不同添加濃度下的回收率、精密度

表3 本方法與其他文獻方法的比較

從表3中可以看出，本方法能夠同時檢測的喹諾酮類參數更多；前處理過程考慮的影響因素更少。在能夠滿足檢測需求，以及達到同等檢測水平的情況下，本方法操作簡單、穩定性好、準確度高且適用于大批量樣品多參數的同時檢測。

2.4 實際應用

以此方法檢測了市場上不同種類蔬菜中喹諾酮類抗生素的殘留情況。隨機抽取白菜、黃瓜、茄子、甘藍等4種蔬菜共12份樣品，均未檢出上述14種抗生素殘留。可能的原因有：本方法只檢測了蔬菜的可食用部分，其他部分是否有喹諾酮類抗生素殘留的情況未知，按照段曉潔[8]的研究結果，抗生素是否遷移到蔬菜其他部位有待研究。

3 結論

本實驗建立了可同時檢測蔬菜中14種喹諾酮類藥物多殘留的超高效液相色譜-串聯質譜法，并優化了QuEChERS方法前處理步驟。將這兩種方法相結合，同時利用同位素內標法降低基質效應，使方法的準確度、精密度、靈敏度、重現性均能滿足分析要求，節省了經濟成本、人員成本和時間成本，能獲得多種參數的同時檢測。