基于水溶性聚合物納米粒熒光猝滅測定Cu(Ⅱ)

潘 宇, 覃小寧, 石柏煊, 梁淑彩*, 鄢國平

(1.武漢工程大學材料科學與工程學院，湖北武漢，430074; 2.武漢大學藥學院，湖北武漢 430072)

銅是自然界大量存在的一種金屬元素，也是人體必需的微量元素，在維持核酸、蛋白質等生物大分子的基本結構，保證生命體正常功能運作方面起著至關重要的作用。但機體對于細胞內Cu(Ⅱ)的含量有著十分嚴格的調控機制，人體中過量Cu(Ⅱ)的存在會引起中毒及導致各種疾病，如腎損傷、阿爾茲海默癥、威爾遜氏病等[1 - 2]。隨著冶金、電子工業的發展，產生了大量的含銅廢水，易于導致銅在生物及環境中聚集，而對環境及食品樣品中的Cu(Ⅱ)進行檢測，可以有效避免Cu(Ⅱ)過量對人體造成傷害。近些年來，借助于熒光探針對Cu(Ⅱ)進行熒光傳感分析的方法因靈敏度高、操作簡單、費用低及能夠實時分析等優點而受到關注。目前，已有大量基于小分子熒光團和納米粒子(如貴金屬納米簇、碳納米粒、無機半導體量子點等)的熒光探針對Cu(Ⅱ)分析測定的報道[3 - 8]。但這些方法大多需要使用有機溶劑，且部分方法還存在探針合成復雜、靈敏度及選擇性不高等缺陷，使它們的應用受到一定限制。因此，具有良好水溶性的Cu(Ⅱ) 熒光探針的研究仍然是Cu(Ⅱ)分析檢測領域的重要任務。

聚合物熒光納米材料在材料科學領域扮演著十分重要的角色，其具有結構多樣性、功能可設計性、生物相容性好等顯著優勢，是一類有著廣泛應用前景的功能材料，作為熒光探針的研究和應用已經受到關注，但目前相關報道還不多[9 - 12]。我們在對N-氨基-4-N-甲基哌嗪-1,8-萘酰亞胺(AMN)接枝聚丙烯酸形成的聚合物納米粒(PAAMN)與金屬離子的傳感測試中發現，在水相中及生理pH條件下，微量Cu(Ⅱ)能使PAAMN的熒光發生顯著猝滅，而其他金屬離子對其熒光影響很小，據此建立了以PAAMN為熒光探針，熒光猝滅法測定Cu(Ⅱ)的新方法，并且成功將其應用于水樣中Cu(Ⅱ)的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F4600型熒光分光光度計(日本，日立高新技術公司);UV-2600型紫外分光光度計(日本，島津制作所);320-S型pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司);KQ-50E型超聲波清洗機；HH-2型恒溫水浴鍋(上海啟前電子科技有限公司)。

PAAMN為本實驗室自制[13]。用水溶解PAAMN配制成濃度為2.0 mg·mL-1的儲備液，置于4 ℃冰箱中保存，臨用時用水稀釋至適當濃度。按常規方法配制濃度為1.0×10-3mol·L-1的各種金屬離子溶液，臨用時用水稀釋至適當濃度。其他試劑為分析純，實驗用水為去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1PAAMN的制備[13]PAAMN參考文獻方法[13]制備。將0.5 g PAA，0.63 g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC·HCl)和0.79 g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)于10 mL的DMF中室溫攪拌反應1 h，然后加入2.2 g AMN的DMF溶液，并于60 ℃攪拌反應4 h。停止反應，將反應液離心除去沉淀，上清液放入透析袋中，在pH=3～4的稀HCl中透析。透析一段時間后將袋內膠狀固體取出，并經過多次堿溶酸沉處理，然后將得到的固體溶解，再于水中透析，并監測透析液的熒光強度。待透析液的熒光強度為零時，凍干透析袋內溶液得PAAMN。經透射電鏡及動態光散射表征，證明其形態為規則球狀顆粒，水合聚合物粒徑為～290 nm，熒光團的摩爾取代度為4.1%。

1.2.2熒光分析測定于刻度試管中，加入100 μL PAAMN溶液，2.0 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.4)，1.0×10-4mol·L-1的Cu(Ⅱ)溶液適量，用水定容至5.0 mL，搖勻。同時進行空白對照。將各溶液于室溫下靜置15 min，然后以390 nm為激發波長，分別測定空白及樣品溶液在534 nm處的熒光強度F0及F，計算相對熒光強度ΔF(ΔF=F0-F)。

1.2.3紫外吸收光譜測定于刻度試管中，加入100 μL PAAMN工作溶液，2.0 mL PBS(pH=7.4)，Cu(Ⅱ)溶液適量，用水定容至5.0 mL，搖勻，室溫下靜置15 min，然后測定溶液的紫外吸收光譜。

2 結果與討論

2.1 PAAMN對不同金屬離子的熒光響應

PAAMN能溶于水得到黃色透明溶液，其具有好的熒光，在水中的熒光量子產率為0.14[13]。在pH為7.4的PBS中，PAAMN的激發和發射光譜如圖1所示。從圖中可以看出，PAAMN的最大激發和發射波長分別為390 nm和534 nm。為了考察PAAMN對不同金屬離子的熒光響應，我們測試了pH=7.4條件下，常見金屬離子Cu(Ⅱ)、Zn2+、Hg(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、Li+、Ba2+、Pb2+、Ag+、Ca2+、Al3+、Co2+、Ni2+、Mn(Ⅱ)、Mg2+對PAAMN的熒光光譜影響。結果發現，上述離子的存在對PAAMN的熒光激發和發射波長沒有影響。在熒光強度方面(圖2)，除了Cu(Ⅱ)能使PAAMN的熒光發生顯著的猝滅，其他金屬離子對PAAMN的熒光強度沒有顯著影響(熒光強度變化<±5%)。因此，PAAMN對Cu(Ⅱ)具有選擇性，可采用熒光猝滅法測定Cu(Ⅱ)。

圖1 PAAMN的熒光激發與發射光譜Fig.1 Fluorescence excitation and emission spectra of PAAMN 1-excitation spectrum;2-emission spectrum;λex=390 nm,λem=534 nm,slit width:10/20 nm;pH=7.4.

圖2 不同金屬離子對PAAMN熒光強度的影響Fig.2 The effect of different metal ions on the fluorescence intensity of PAAMNλex=390 nm,λem=534 nm.

2.2 Cu(Ⅱ)對PAAMN的熒光猝滅機理

圖3 Cu(Ⅱ)加入前后PAAMN的紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜Fig.3 UV-Vis absorption spectra of PAAMN with and without Cu(Ⅱ) PAAMN: 0.2 mg·mL-1; Cu(Ⅱ): 5.0×10-6 mol·L-1;pH=7.4.

熒光猝滅機理分為動態猝滅和靜態猝滅，前者指熒光物質與猝滅劑相碰撞而導致熒光強度的降低，一般不會引起物質結構的變化；后者是由于熒光物質與猝滅劑形成非熒光的復合物。紫外吸收光譜是表征熒光猝滅機理的常用手段，通常伴隨著紫外吸收光譜變化的熒光猝滅為靜態猝滅，否則為動態猝滅[14]。從結構上看，PAAMN含有豐富的N原子和O原子，易于和Cu(Ⅱ)形成絡合物導致熒光猝滅。為驗證Cu(Ⅱ)對PAAMN的靜態猝滅作用，測定了Cu(Ⅱ)加入前后PAAMN的紫外-可見吸收光譜，結果如圖3所示。從圖中可以看出，Cu(Ⅱ)加入使PAMMN吸光強度減小，出現明顯的減色效應，說明Cu(Ⅱ)與PAAMN之間確實形成了新的Cu(Ⅱ)/PAAMN體系，Cu(Ⅱ)對PAAMN的熒光猝滅屬于靜態猝滅。

2.3 測定條件優化

2.3.1緩沖溶液pH值的影響以PBS為介質，考察pH在5.0～9.5范圍內Cu(Ⅱ)對PAAMN熒光強度的影響。從圖4所示結果可以看出，隨著pH的升高，ΔF逐漸增大，在pH為7.0時達到最大值并在pH=7.0～8.0范圍內趨于穩定，隨后逐漸減小。因此，最終選擇pH=7.4為測定Cu(Ⅱ)的最優pH條件。

2.3.2反應溫度和時間的影響考察了不同溫度(37 ℃、60 ℃)下，ΔF隨反應時間的變化，結果如圖5所示。從圖中可見，各測定溫度下，ΔF均隨著反應時間增加而逐漸加大，升高溫度僅使PAAMN與Cu(Ⅱ)的前期反應速率略微加快。各溫度下均需要反應15 min才能達到最大值，且最大值間沒有明顯不同。為了操作方便，本實驗選擇PAAMN與Cu(Ⅱ)在室溫下反應15 min后測定。

圖4 pH值對ΔF的影響Fig.4 The influence of pH on ΔFλex=390 nm,λem=534 nm.

圖5 反應時間和溫度對ΔF的影響Fig.5 Effect of reaction time and temperature on ΔF-room temperature,-37 ℃,-60 ℃;λex=390 nm,λem=534 nm.

2.3.3試劑加入順序及穩定性在選定的實驗條件下測定了緩沖溶液、Cu(Ⅱ)及PAAMN的加入順序對ΔF的影響。實驗證明，改變試劑加入順序對ΔF沒有影響。此外，該測定體系具有良好的穩定性，反應完全后的ΔF值在室溫下至少可以穩定24 h。

2.4 干擾實驗

當Cu(Ⅱ)濃度為5.0×10-6mol·L-1時，考察了常見金屬離子對測定的影響。實驗證明，在允許誤差≤±5%范圍時，以下量的共存離子不干擾：1 000倍的Zn2+、Fe(Ⅲ)、Hg(Ⅱ)、Ba2+、Ni2+、Ca2+、Co2+、Pb2+及Li+，100倍的Al3+、Mg2+及Mn(Ⅱ)，50倍的Ag+。

2.5 線性范圍、檢測限和精密度

在選擇的最佳實驗條件下，測定了ΔF隨著Cu(Ⅱ)濃度的變化情況，并繪制工作曲線。結果表明，ΔF值隨著Cu(Ⅱ)濃度增大而增加，并且與0.1～5.0×10-6mol·L-1的Cu(Ⅱ)濃度呈良好線性關系，線性回歸方程為:ΔF=156.39c+31.475，相關系數為0.9952，測定Cu(Ⅱ)的檢測限為1.3×10-8mol·L-1。說明PAAMN測定Cu(Ⅱ)具有較高的靈敏度，可以用于環境水樣，甚至是飲用水樣品中Cu(Ⅱ) 的測定[15 - 16]。

對濃度為5.0×10-7mol·L-1、1.0×10-6mol·L-1和5.0×10-6mol·L-1的Cu(Ⅱ)分別測定6次，計算相對標準偏差(RSD)分別為1.2%、2.4%和2.3%。說明該測定方法具有較好的精密度。

2.6 樣品測定

按1.2.2中所示方法，采用標準加入法測定了自來水、東湖水以及市售飲用純凈水中的Cu(Ⅱ)濃度。東湖水樣測定前進行了過濾，其它樣品未經任何處理。自來水和東湖水樣品的加標量均為0.2 mL，純凈水樣品的加入量為1.0 mL。樣品加標回收測定結果見表1。

表1 水樣分析結果

3 結論

根據在水相及生理pH條件下，Cu(Ⅱ)能使水溶性聚合物納米粒PAAMN的熒光發生顯著降低，并且在一定范圍內熒光猝滅程度隨著Cu(Ⅱ)濃度增大而增加這一現象，建立了一種以PAAMN為熒光探針，熒光猝滅法檢測水樣中Cu(Ⅱ)濃度的新方法。該方法測定Cu(Ⅱ)的線性范圍為0.1～5.0×10-6mol·L-1，檢測限為1.3×10-8mol·L-1。方法具有探針水溶性好，測定波長的Stokes位移大，對Cu(Ⅱ)的選擇性和靈敏度高，系統穩定性好等特點，可應用于水樣中Cu(Ⅱ)的檢測。