表面等離子共振技術(shù)快速測定蛋白A與抗人T細(xì)胞單克隆抗體結(jié)合的反應(yīng)常數(shù)

張 暉， 薛洪寶， 陳飛劍， 王 杰， 王 充， 李柏青*

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室,安徽蚌埠 233030； 2.蚌埠醫(yī)學(xué)院感染與免疫安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽蚌埠 233030)

表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)是應(yīng)用金屬表面等離子與入射光產(chǎn)生共振的一種物理光學(xué)現(xiàn)象[1 - 3]，為一種實(shí)時(shí)監(jiān)測生物傳感芯片上的配體與分析物相互作用全過程的新型技術(shù)手段[4]。與傳統(tǒng)方法相比，它最大優(yōu)點(diǎn)就是不需對(duì)分析物進(jìn)行標(biāo)記，靈敏度高、專屬性強(qiáng)、消耗樣品少[5 - 7]。該技術(shù)是對(duì)生物分子相互作用進(jìn)行檢測研究比較理想的方法之一[8]，目前已廣泛用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、抗原-抗體反應(yīng)以及細(xì)胞、病毒、細(xì)菌間的相互作用分析[9 - 12]。

蛋白質(zhì)A(Protein A)來源于金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁[13]，在一定酸度(pH=1～10)下能夠維持其活性，且穩(wěn)定性非常好。蛋白A活性非常強(qiáng)，能與大部分哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白(抗體)發(fā)生特異性結(jié)合[14]，并且不同免疫球蛋白與蛋白A的特異性結(jié)合難易程度不同，甚至差異很大[15]。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)抗原-抗體特異性結(jié)合性質(zhì)，運(yùn)用SPR生物傳感器技術(shù)，探索建立測定兩種抗人T細(xì)胞表面分子的單克隆抗體(抗人TCRγδ和抗人CD3-PE)分別和蛋白A結(jié)合的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)常數(shù)的方法。實(shí)驗(yàn)測出了這兩個(gè)特異性結(jié)合的動(dòng)力學(xué)常數(shù)：結(jié)合速率常數(shù)ka、解離速率常數(shù)kd、活化能Ea，以及平衡常數(shù)Ka、焓變?chǔ)等熱力學(xué)常數(shù)，目前這類數(shù)據(jù)在文獻(xiàn)里非常少見。為蛋白A分離和純化抗體調(diào)整操作條件，避免主觀盲目性，提高效率，提供必要的科學(xué)參考，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SR 7500DC型雙通道SPR儀、蛋白A檢測芯片(Planar Protein A Sensor Chip)購于美國Reichert公司；pHS-3C酸度計(jì)(上海科學(xué)儀器有限公司)；0.22 μm水相混合纖維素酯膜(海寧市正興特種過濾設(shè)備制造有限公司)。

抗人CD3單克隆抗體-藻紅蛋白(PE)復(fù)合物(CD3-PE)溶液，IgG2a，20 μg/mL，購自天津協(xié)科生物科技有限公司；抗人TCRγδ單克隆抗體(TCRγδ)，純化凍干粉，購自Beckman-Coulter公司(編號(hào)：IM1349)，IgG1,0.1 mg/manch，根據(jù)說明用0.5 mL超純水溶解，用抗體稀釋液稀釋至40 μg/mL。NaOH、HCl、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸等試劑均為分析純。超純水(18.2 MΩ·cm)由杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司的實(shí)驗(yàn)室純水和超純水系統(tǒng)提供。PBST-疊氮鈉(0.1%)運(yùn)行緩沖溶液pH值(7.10至8.48)用稀HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)。通過SPR儀的所有溶液都要經(jīng)過0.22 μm的濾膜過濾，再進(jìn)行脫氣處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取出SPR儀流通池，放置蛋白A傳感芯片后，用PBST-疊氮鈉緩沖溶液(pH=7.36)運(yùn)行至基線穩(wěn)定后，以右通道為參比通道，左通道注入抗人TCRγδ單克隆抗體或抗人CD3-PE溶液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定不同流速和運(yùn)行時(shí)間。結(jié)束后用0.5%SDS-50 mmol/L甘氨酸(pH=2.00)緩沖溶液洗去表面結(jié)合的TCRγδ或CD3-PE，隨即用PBST-疊氮鈉運(yùn)行緩沖溶液沖洗，等基線穩(wěn)定后再進(jìn)行下一次進(jìn)樣。TCRγδ或CD3-PE與蛋白A的反應(yīng)進(jìn)程以響應(yīng)折射率(Refractive Index Unit，RIU)表示，并且RIU值與TCRγδ或CD3-PE和蛋白A特異性結(jié)合的數(shù)量(即反應(yīng)強(qiáng)度)呈正相關(guān)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

傳感圖曲線根據(jù)左通道數(shù)據(jù)扣除右通道(參比)數(shù)據(jù)繪出，再運(yùn)用Integrated SPR Autolink 和Clamp XP軟件分析和擬合，計(jì)算結(jié)合速率常數(shù)ka、解離速率常數(shù)kd。ka或結(jié)合平衡常數(shù)Ka和溫度間的關(guān)系采用Origin 8.0軟件處理、統(tǒng)計(jì)、分析和作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A反應(yīng)條件選擇

圖1 pH對(duì)TCRγδ與蛋白A結(jié)合影響的傳感圖Fig.1 SPR sensorgrams of effect of pH on TCRγδ monoclonal antibody(TCRγδmAb) interacting with protein A pH:8.48(a)，7.90(b)，7.62(c)，7.33(d)，7.10(e).

2.1.1酸度對(duì)抗體與蛋白A反應(yīng)的影響用pH分別為7.10、7.33、7.62、7.90、8.48的PBST-疊氮鈉溶液作為運(yùn)行緩沖溶液，再分別用上述pH的PBST-疊氮鈉溶液配制TCRγδ濃度一定的溶液，進(jìn)樣分析，傳感圖見圖1。由圖1可知，在所實(shí)驗(yàn)的溶液pH范圍內(nèi)，pH升高，TCRγδ抗體與蛋白A反應(yīng)能力增強(qiáng)，但pH>7.90時(shí)，兩者的結(jié)合能力增加甚微；同樣的方法可以得到CD3-PE抗體與蛋白A反應(yīng)強(qiáng)度在pH=7.90附近比較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)選擇pH為7.90作為體系反應(yīng)的酸度條件。

2.1.2離子強(qiáng)度對(duì)抗體與蛋白A反應(yīng)的影響含有NaCl濃度為0、25、50、75、100 mmol/L的PBST-疊氮鈉溶液(pH=7.90)分別作為運(yùn)行緩沖溶液，以上述運(yùn)行緩沖溶液配制濃度一定的TCRγδ或CD3-PE溶液并進(jìn)樣分析。由所得結(jié)果可知，TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A反應(yīng)響應(yīng)值(即反應(yīng)強(qiáng)度)隨NaCl濃度(即離子強(qiáng)度)的升高而增強(qiáng)。這說明較高的離子強(qiáng)度對(duì)該反應(yīng)有促進(jìn)作用。但是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，高離子強(qiáng)度對(duì)反應(yīng)體系中其它蛋白質(zhì)雜質(zhì)和蛋白A的反應(yīng)也有促進(jìn)作用，即高離子強(qiáng)度使反應(yīng)的選擇性降低。所以本實(shí)驗(yàn)選擇含NaCl濃度為75 mmol/L，pH=7.90的PBST-疊氮鈉溶液作為運(yùn)行緩沖溶液。

2.2 方法重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

以含75 mmol/L NaCl的PBST-疊氮鈉溶液(pH=7.90)配制濃度一定的TCRγδ和CD3-PE溶液，分別進(jìn)樣分析5次。分別計(jì)算兩抗體與蛋白 A 反應(yīng)響應(yīng)最大值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.68%和4.95%。說明該方法能夠用于測定TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A 反應(yīng)的ka和kd。

2.3 TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A特異性結(jié)合的ka和kd的測定

溫度20 ℃時(shí)，濃度不同的TCRγδ或CD3-PE溶液進(jìn)樣后，所得傳感圖見圖2和圖3。

圖2 20 ℃時(shí)不同濃度TCRγδ與蛋白A結(jié)合傳感圖Fig.2 SPR sensorgrams of effect of concentrations of TCRγδmAb on TCRγδmAb interacting with protein A at 20 ℃ Concentrations of TCRγδmAb(mol/L)：5.00×10-8(a)，3.33×10-8(b)， 8.35×10-9(c)，4.18×10-9(d)，2.08×10-9(e).

圖3 20 ℃時(shí)不同濃度的CD3-PE與蛋白A結(jié)合傳感圖Fig.3 SPR sensorgrams of effect of concentrations of CD3-PE on CD3-PE interacting with protein A at 20 ℃ Concentrations of CD3-PE(mol/L)：2.67×10-8(a)，1.33×10-8(b)，6.67×10-9(c)， 3.33×10-9(d)，1.67×10-9(e).

將圖2和圖3中的數(shù)據(jù)通過Clamp XP軟件處理，得到TCRγδ或CD3-PE與蛋白A結(jié)合的動(dòng)力學(xué)常數(shù)：ka和kd(20 ℃)，并計(jì)算出熱力學(xué)常數(shù)：Ka(20 ℃)，見表1。表1中數(shù)據(jù)比較接近文獻(xiàn)報(bào)道[17]中的ka、kd與Ka值，實(shí)驗(yàn)時(shí)所選擇的反應(yīng)體系的酸度、離子強(qiáng)度等結(jié)合條件的差異是兩組數(shù)據(jù)存在差異的原因。

表1 蛋白A與TCRγδ或CD3-PE的結(jié)合常數(shù)(20 ℃)

Note:ka,association rate constant;kd,dissociation rate constant;Ka(Ka=ka/kd),association equilibrium constant.

TCRγδ或CD3-PE分別與蛋白A反應(yīng)的Ka值(107數(shù)量級(jí))很接近，表明蛋白A 分別與TCRγδ或CD3-PE反應(yīng)程度(即親和力)差別不大，并且為中等強(qiáng)度結(jié)合。

2.4 TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A反應(yīng)活化能(Ea)、焓變(ΔH)的測定

分別在溫度15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃下，實(shí)驗(yàn)不同濃度的TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A的反應(yīng)情況，根據(jù)傳感圖得到上述溫度下兩反應(yīng)的ka、kd，并計(jì)算出Ka。運(yùn)用作圖法可求出Ea、ΔH。

2.4.1抗體與蛋白A反應(yīng)Ea的測定根據(jù)Arrhenius方程[18]：

lgk=-Ea/2.303RT+lgA

(1)

式中，k表示反應(yīng)速率常數(shù)，Ea表示反應(yīng)活化能，R表示氣體常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，A為一常數(shù)。由公式(1)可知，以lgk對(duì)1/T作圖，得到一條直線，直線的斜率為-Ea/2.303R，由此計(jì)算出Ea。

以15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的TCRγδ或CD3-PE與蛋白A反應(yīng)的結(jié)合速率常數(shù)的對(duì)數(shù)lgk對(duì)1/T作圖，得圖4。由圖4可知，TCRγδ與蛋白A反應(yīng)結(jié)合速率常數(shù)的對(duì)數(shù)和溫度具有較好的線性關(guān)系，回歸直線的相關(guān)系數(shù)r=0.9707,說明該反應(yīng)符合公式(1)。直線的斜率-Ea/2.303R為-5.1967±0.6379，由此計(jì)算出TCRγδ與蛋白A反應(yīng)的Ea=(99.50±12.21) kJ·moL-1；同樣，CD3-PE與蛋白A反應(yīng)結(jié)合速率常數(shù)和溫度關(guān)系的回歸直線的相關(guān)系數(shù)r=0.9598，斜率為-6.7181±0.9725，Ea=(128.63±18.62)kJ·moL-1。TCRγδ或CD3-PE與蛋白A反應(yīng)的Ea比較接近，即兩種抗體分別和蛋白A反應(yīng)時(shí)所需要的能量相差不大，所以兩者與蛋白A反應(yīng)的ka很接近，見表1或圖4；溫度越高，ka或kd越大，見圖4。

2.4.2抗體與蛋白A反應(yīng)ΔH的測定根據(jù)Van’t Hoff方程[18]:

lgK=-ΔH/2.303RT+I

(2)

式中，K是在絕對(duì)溫度T下的結(jié)合平衡常數(shù)，ΔH是焓變，R是氣體常數(shù)，I為積分常數(shù)。由公式(2)可知，由結(jié)合平衡常數(shù)的對(duì)數(shù)lgK對(duì)對(duì)應(yīng)的溫度的倒數(shù)1/T做圖，得到一條直線，其斜率為-ΔH/2.303R，可計(jì)算出ΔH。

以15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的TCRγδ或CD3-PE與蛋白A反應(yīng)的結(jié)合平衡常數(shù)的對(duì)數(shù)lgK對(duì)1/T作圖，得圖5。由圖可得，TCRγδ與蛋白A反應(yīng)結(jié)合平衡常數(shù)的對(duì)數(shù)和溫度有良好的線性關(guān)系，回歸直線的相關(guān)系數(shù)r=0.9784，說明該反應(yīng)符合公式(2)，直線的斜率-ΔH/2.303R為1.7337±0.1819，由此計(jì)算出TCRγδ與蛋白A反應(yīng)的ΔH=(-33.20±3.48) kJ·moL-1；同理，CD3-PE與蛋白A反應(yīng)結(jié)合平衡常數(shù)和溫度關(guān)系的回歸直線的相關(guān)系數(shù)r=0.9811，斜率為-4.9844±0.4898，ΔH=(95.43±9.38) kJ·moL-1。TCRγδ或CD3-PE與蛋白A反應(yīng)的ΔH值告訴我們：TCRγδ抗體與蛋白A反應(yīng)為放熱反應(yīng)，低溫時(shí)二者的結(jié)合程度較大；CD3-PE抗體與蛋白A反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，高溫有利于兩者的結(jié)合，見圖5。

圖4 TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A反應(yīng)結(jié)合速率常數(shù)和溫度的關(guān)系Fig.4 The relationship between temperature and association rate constant of the interaction of two antibodies with protein A respectively The interaction of TCRγδmAb with protein A; The interaction of CD3-PE with protein A.

圖5 TCRγδ或CD3-PE抗體與蛋白A結(jié)合平衡常數(shù)和溫度的關(guān)系Fig.5 The relationship between temperature and association equilibrium constant of the interaction of two antibodies with protein A respectively The interaction of TCRγδmAb with protein A; The interaction of CD3-PE with protein A.

本文中TCRγδ或CD3-PE兩種抗體分別與蛋白質(zhì)A反應(yīng)的ka、Ka和Ea比較接近，但兩反應(yīng)ΔH有些差異。我們認(rèn)為TCRγδ和CD3兩抗體類型相同、結(jié)構(gòu)相近、性質(zhì)類似，與蛋白A反應(yīng)時(shí)的ka、Ka和Ea很接近，說明抗人CD3單克隆抗體與藻紅蛋白(PE)結(jié)合形成復(fù)合物CD3-PE后對(duì)CD3的活性基本上沒有影響。但當(dāng)CD3-PE與蛋白A特異性結(jié)合時(shí)，可能伴隨復(fù)合物CD3-PE中部分CD3與PE間化學(xué)鍵的松弛而吸收能量，導(dǎo)致抗人CD3-PE與蛋白A結(jié)合的ΔH與TCRγδ與蛋白A結(jié)合的ΔH有點(diǎn)差異。這一點(diǎn)尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

3 結(jié)論

本研究采用SPR技術(shù)測定兩種抗人T細(xì)胞單克隆抗體(抗人TCRγδ和抗人CD3-PE抗體)與蛋白質(zhì)A特異性結(jié)合的動(dòng)力學(xué)常數(shù)和熱力學(xué)常數(shù)，為抗體純化和免疫分析提供參考和必要的理論支撐。該方法不需對(duì)分析物進(jìn)行標(biāo)記，快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、消耗樣品少，是檢測和分析抗體和蛋白質(zhì)A相互作用較理想的方法之一。