基于環化腺苷的自發熒光特性用熒光光譜法直接測定注射劑的中環磷腺苷

翁文婷， 謝曉蘭， 黃曉平， 陳檐芬

(1.泉州師范學院化工與材料學院，福建泉州 362000; 2.華僑大學材料科學與工程學院，福建廈門 361021)

圖1 環磷腺苷(cAMP)的化學結構式Fig.1 Chemical structures of cAMP

環磷腺苷(cAMP)為6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-9H-嘌呤-4′,5′-環磷酸氫酯，別名環化腺苷酸，其結構見圖1。cAMP作為蛋白激酶致活劑，是人體內廣泛存在的具有生理活性的一種重要物質，它作為參與調節細胞功能的第二信使物質，在臨床上應用廣泛。cAMP屬于核苷酸的衍生物，是由三磷酸腺苷(ATP)通過腺苷酸環化酶(AC)催化下反應生成，對于多種體內功能活動均起到調節作用[1]。自從1998年發現了cAMP效應分子Epac，使人們對cAMP信號通路中的相關分子與途徑有了新的認識[2 - 3]。最近的研究結果顯示，受上游信號cAMP刺激時，cAMP直接激活的交換因子Epac會將小分子G蛋白酶Rap結合的無活性(GDP)置換為活性(GTP)，并激活Rap，從而使Rap發揮重要信號分子作用，進而調節細胞增殖、基因表達或者細胞黏附和遷移等系統機能活動[4]。這也證明了信號分子cAMP對于調節機體整體活動的協調性和精確性等方面起重要作用[5 - 6]。因此，對cAMP含量的準確檢測方法的研究很有意義。cAMP早前運用較廣泛的是Gilman的蛋白結合檢測法[7]和免疫檢測法[8]，其他生物熒光方法也能較好追蹤活體細胞中cAMP的變化[9]，但是操作相對復雜。盛國榮等采用計算分光光度法建立復方cAMP中環乳膏的質量控制標準[10]，但需要進行復雜的計算分離過程，線性范圍較窄。高效液相色譜(HPLC)作為靈敏的藥物分析檢測手段被收錄在《中國藥典》(2015版)中[11]，運用該方法對cAMP的藥理和含量檢測的研究也有報道[12 - 14]。熒光分光光度法因靈敏度高、操作簡單、快速靈敏等優點已廣泛應用于生物小分子的檢測和藥理分析的研究中[15 - 16]。基于熒光共振能量轉移(FRET)效應，可設計生物熒光傳感器用于精確研究活體細胞中cAMP的藥理和動態變化[17 - 20]。但是，利用cAMP的自身結構的熒光效應，采用直接熒光光譜法測定其含量的研究罕見報道。

我們前期研究發現，cAMP水溶液具有非環狀的腺苷結構不具備的自發熒光性質，而且熒光光譜明顯區別于嘌呤環所產生的熒光信號。通過加熱并進行溶液條件的優化后，pH=2.0的cAMP溶液在最佳激發波長285 nm條件下，于393 nm處具有最佳的熒光發射信號，熒光量子產率為4.28%，具有穩定的光漂白性和光譜不依賴性質。本實驗利用cAMP的含量與熒光強度在一定條件下呈良好的線性關系，建立起一種直接快速的測定環磷腺苷注射劑中cAMP含量的新方法。與現有檢測方法相比，該直接熒光法具有準確度高、操作簡單、成本低廉和綠色環保等優點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Cary eclipse熒光分光光度計(美國，Varian公司)；UV-2600紫外-可見分光光度計(日本，Shimazu公司)；F-7000熒光分光光度計(日本，Hitachi公司)；FLS920熒光光譜儀(英國，Edinburgh Instruments)；HPLC-6460Q液-質聯用儀(美國，Agilent公司)，配電噴霧離子(ESI)源；ZetaPALS Zeta電位及粒徑分析儀(美國，布魯克海文儀器公司)。

腺嘌呤(ANE，Mr=135.13)，腺嘌呤核苷(ANS，Mr=267.24)，腺苷一磷酸二鈉(AMP，Mr=499.19)，環磷腺苷(cAMP，Mr=329)，均為分析純試劑，購于上海阿拉丁試劑公司。準確稱取ANE、ANS、AMP和cAMP的對照品，分別配制1.0×10-2mol/L的儲備溶液，保存于4 ℃冰箱。臨用前根據需要，用0.1 mol/L HCl和NaOH溶液將儲備液稀釋成不同pH的1.0×10-4mol/L工作液。pH=1.98～10.38 B-R緩沖溶液：由0.04 mol/L的H3PO4、H3BO3和HAc混合酸加入不同量的0.2 mol/L NaOH配制而成。其余的試劑均為分析純；實驗所用水為超純水。

cAMP注射劑(山東濰坊制藥廠有限公司，批號：745150501，745150505，745150507)：規格為40 mg：5 mL，用超純水稀釋成40 mg/L溶液，置于冰箱中5 ℃儲存。

1.2 實驗方法

1.2.1熒光光譜和紫外光譜分析移取5 mL對照品操作液，加入等量的不同pH緩沖溶液，稀釋成5.0×10-5mol/L溶液，于熒光分光光度計上，設置狹縫5.0/10.0 nm,激發波長λex=285 nm，在290～550 nm范圍內進行熒光光譜分析。同時在紫外分光光度計上掃描吸收光譜。設置光譜狹縫為2.5 nm，以純溶劑為空白參比液，在300～600 nm范圍內進行吸收光譜分析。

1.2.2cAMP的高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)分析采用ZORBAX Eclipse Plus C18(RRHD)色譜柱(50×2.1 mm，1.8 μm)，以超純水作為流動相A，以色譜純甲醇作為流動相B，梯度洗脫，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃；進樣量5 μL。質譜采用ESI離子源；掃描方式：正、負離子同時掃描；采集方式：多反應監測(MRM)；離子源溫度：350 ℃；毛細管溫度：300 ℃；毛細管電壓：正、負離子模式下均為4.0 kV；鞘氣氣流：11 L/min。取cAMP標準品和注射劑各適量，加流動相A制成每1 L中分別含50 μg的操作溶液，作為系統適用性試驗溶液，進行高效液相色譜實驗。

1.2.3cAMP注射劑樣品的熒光光譜測定準確移取cAMP注射液，稀釋200倍，制成40 μg/mL溶液后，再稀釋成0.4 μg/mL溶液，于熒光分光光度計上，設置狹縫5.0/10.0 nm，激發波長λex=285 nm，在290～550 nm范圍內進行熒光光譜分析，同時用水進行空白對照實驗。

2 結果與討論

2.1 cAMP的內源性熒光機理初探

按照操作步驟，分別配制不同pH條件下1.0×10-4mol/L的ANE、ANS、AMP和cAMP溶液，進行熒光光譜測定，如圖2所示。在各種溶液體系中，只有ANE因剛性的嘌呤環平面結構而具有自發熒光特性和穩定的熒光強度，熒光光譜的激發峰位置隨著pH的增加而發生紅移并伴隨著Stocks位移的減小(表1)，這是因為結構上的伯胺基團質子化程度不同而導致的。在酸性條件下，4種物質均有明顯熒光信號，ANE的最大激發和最大發射波長分別為287、381 nm，光譜的Stokes位移是94，當分子上連接上戊糖結構后，無論是核苷還是腺苷結構，熒光光譜的Stokes位移明顯增大到105以上，當在ANS的結構上引入磷酸形成AMP，磷酸的位阻效應使雜環結構剛性增強，而且在強酸性環境下易質子化，從而使原來熒光體的最低單線激發態S1為n、π*型轉化為π、π*，因此熒光強度明顯增強。這也進一步解釋了在中性溶液環境中，非質子化的非剛性結構導致ANS和AMP沒有熒光特性[21]。

圖2 不同pH條件下1.0×10-4 mol/L ANE、ANS、AMP和cAMP的熒光光譜圖 Fig.2 Fluorescence spectra of ANE，ANS，AMP and cAMP in different pH with 1.0×10-4 mol/L

表1 ANE、ANS、AMP和cAMP的熒光光譜特征峰數據(nm)

但是一旦磷酸鏈接到糖環上形成cAMP，兩個大雜環結構因C-C鍵隔開，形成特殊的基態轉動構型，導致cAMP在中性環境中也具有特有的自發熒光現象。此時，cAMP的最大激發和發射波長分別為285、393 nm，具有最大的Stokes位移，可明顯區別于嘌呤體系。對應的紫外光譜如圖3(a)所示，4種物質的吸收峰位置均相同，說明發生紫外吸收的特征結構沒有明顯改變。很明顯采用紫外光譜和紫外檢測器的高效液相色譜法來測定cAMP的含量，其方法選擇性不如熒光光譜。因此通過測定cAMP的熒光強度進行含量分析具有較高可行性。

圖3 B-R緩沖溶液(pH=2.0)中ANE、ANS、AMP與cAMP的紫外(UV)光譜圖(a)和cAMP的色譜(b)與質譜圖(c) Fig.3 UV spectra of ANE,ANS,AM,cAMP in B-R buffer(pH=2.0)(a)，chromatograms(b) and mass spectrum(c) of cAMP

2.2 cAMP的質譜分析

按實驗方法中操作步驟，對cAMP進行結構分析，結果如圖3(b)所示，在最優化條件下得到的質譜圖上有明顯三組峰(m/z327.9、m/z133.8、m/z106.9)，分別對應著cAMP脫去一個H+的主分子離子峰，C-C 斷裂形成的ANE碎片峰和脫去了磷酸后的戊糖分子碎片峰。實驗結果表明沒有其它雜峰存在，進一步說明cAMP具有穩定的兩個雜環結構，可在強酸性條件下以自身特殊的構型存在，并形成自發熒光。

2.3 cAMP熒光體系的條件優化

2.3.1溶劑類型和用量的影響按照操作步驟，分別配制1.0×10-4mol/L cAMP的水、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯和甲醇溶液，混勻、靜置15 min后。分別在熒光分光光度計上測量熒光光譜。實驗結果表明，除在純水中，其他溶劑均會干擾cAMP的熒光信號，使其熒光峰位置發生改變，強度下降。在純水環境下cAMP的熒光達到最強，所以本實驗選擇純水作為溶劑。

2.3.2緩沖溶液類型和pH值的影響測定了不同pH值條件下cAMP水溶液的熒光光譜，結果如圖4所示。酸性條件下cAMP具有較強的熒光信號，熒光強度隨溶液酸性增強而逐漸變大，在pH=2.0時熒光強度最大，酸性進一步增強熒光強度反而下降。這可能是因為分子結構中的磷酸根在pH=2.0左右最易質子化而導致的。隨后考察pH=2.0的鄰苯二甲酸氫鉀、NaHPO4-檸檬酸、檸檬酸-NaOH-HCl和B-R緩沖溶液對熒光信號的影響。結果表明，cAMP在B-R緩沖液中熒光最強。所以本實驗選擇pH=2.0的B-R緩沖溶液為最佳反應條件。

圖4 不同pH的B-R緩沖溶液中cAMP的熒光光譜(a)、熒光強度(b)和熒光發射波長(c)隨pH的變化趨勢圖Fig.4 The fluorescence spectra of cAMP at different pH B-R buffer(a),relationship between fluorescentce intensity(b) and emission wavelength(c) with pH

圖5 不同激發波長下cAMP的發射光譜(a)、發射波長(b)和熒光強度隨激發波長的變化(c)趨勢圖(狹縫5.0/5.0 nm)Fig.5 The emission spectra of the cAMP solution at different excitation wavelength(a),emission wavelength(b) and relationship of fluorescentce intensity(c) with excitation wavelength(slit=5.0/5.0 nm)

2.3.3溫度的影響按照實驗方法中的步驟，將配制好的cAMP溶液分別在不同水浴溫度下加熱2 h，冷卻到室溫法后，在熒光分光光度計上測定熒光光譜。結果顯示，體系在50 ℃溫度下反應一定時間，可有效增強其熒光強度，所以本實驗選擇50 ℃作為最佳加熱溫度。

2.3.4重現性實驗取cAMP標準操作溶液，進行最優化條件處理后，于熒光分光光度計上測定熒光強度[16]，平行測定10次，其相對標準偏差(RSD)為1.08%。說明該體系具有較好的重現性。

2.3.5cAMP溶液的熒光光譜性能按實驗方法，采用不同激發波長對cAMP進行發射光譜掃描，結果如圖5所示。在不同波長激發下cAMP的熒光發射光譜的最大發射峰位置沒有明顯改變，但是熒光強度先增后降，在激發為285 nm時達到最高。這種激發光譜不依賴性質和熒光染料分子發光的特性是一致的，這也進一步驗證cAMP自發熒光的可行性。

2.4 工作曲線與檢出限

按照實驗方法，準確移取一系列不同濃度的cAMP標準溶液，于熒光分光光度計上測定熒光強度。結果表明：cAMP在1.0×10-6～1.0×10-5mol/L濃度范圍與其熒光強度呈現良好線性關系，線性方程為：F=44.87+1.897×107ccAMP(mol/L)，相關系數r=0.9991,檢出限(3S0/K)為1.708×10-9mol/L。將該熒光法測定所得結果與高效液相色譜法[11]相比較，結果一致。

2.5 共存物質的影響

2.6 注射劑中CAMP的含量測定

取稀釋后注射劑樣品溶液，分別添加低、中、高3個水平的混合標準溶液，在優化的實驗條件下目標化合物的回收率在98.3%～110.0%之間，RSD≤4.9%(表2)，可滿足實際分析的要求。

表2 注射劑樣品測定結果與加標回收率(n=6)

3 結論

環磷腺苷在酸性至中性溶液環境中會呈現穩定的熒光光譜，最佳激發/發射波長為285/393 nm。在pH=2.0的B-R緩沖溶液中，50 ℃水浴加熱2 h后達到最佳熒光強度，量子產率為4.28%。由此建立了一種直接熒光法測定cAMP的新方法。實驗表明，本法操作簡便，重現性好，精確度高等優點，測定結果較準確，可用于注射劑中環磷腺苷含量的測定。