層層自組裝多壁碳納米管在線固相萃取堿性蛋白質

周嬋媛， 李曉煥， 王 壹， 楊秀群， 杜 超， 嚴 偉

(貴陽學院化學與材料工程學院，貴州貴陽 550005)

蛋白質是維持生命活動的重要基礎，因此，對蛋白質的分離富集是分離科學的一個重要研究領域。然而生物樣品基體復雜，待測物含量低，需經分離富集后才能進行檢測。在線固相萃取技術具有操作簡單、易實現樣品無溶劑(或少溶劑)處理、準確度和靈敏度高、節省時間等優點。但目前用于蛋白質萃取介質的種類有限,因此開發具有高萃取效率和高選擇性的萃取介質對提高蛋白質分離效果具有重要的意義。

碳納米管為一維納米材料，表面有豐富的π電子，疏水性強，具有良好的化學穩定性、熱穩定性和高比表面積等優點，在固相萃取方面得到廣泛應用[5 - 8]。近年來，碳納米管在蛋白質分離富集方面引起廣大研究者的極大興趣與關注[9 - 14]。然而，以碳納米管作為在線固相萃取的吸附劑時，非常細小的碳納米管常常會發生團聚，導致其有效比表面積明顯降低，從而大大降低系統的吸附容量[15]。為此，研究者們將碳納米管材料負載到不同的剛性基底表面以提高吸附效率，如玻璃基體、SiO2或聚合物整體柱[16 - 18]等。Du等[19]通過該方法成功制備了MWNTs/SiO2復合微球，將聚合物包覆在硅膠表面，實現了對細胞色素c的分離富集。石英棉(QW)具有高比表面積和高電荷密度等特性，在對金屬離子、有機污染物的吸附，生物大分子和細胞的分離領域已有廣泛的應用[21 - 22]。本文采用層層自組裝法將羧基化多壁碳納米管(c -MWNTs)負載于QW表面，制備c -MWNTs/QW在線固相萃取柱，以血紅蛋白(Hb)和溶菌酶(Lyz)作為模型蛋白，將c -MWNTs/QW固相萃取柱與順序注射系統聯用，實現了從復雜生物基體中分離富集堿性蛋白。本課題組在前期研究中制備了poly(MMA-EDMA-MWCNT)復合整體柱[20]。因MWNTs的加入增大了整體柱的比表面積，從而提高了對蛋白質分離富集能力。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

FIAlab-3000順序注射系統(美國，FIAlab Instruments)；T6紫外/可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；DYCZ-28A垂直式電泳槽(北京市六一儀器廠)；Orion 868型酸度計(美國，ThermoElectron公司)；IR-prespige-21傅立葉紅外光譜儀(日本，島津公司)；電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

溶菌酶(Lyz，14.4 kDa)、牛血紅蛋白(Hb，15.5 kDa)(美國Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，68 kDa)(上海卓康生物科技有限公司))；聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDDA，Mw=400～500 kDa)(美國Sigma公司)；聚苯乙烯磺酸鈉(PSS，Mw=70 kDa)(美國Sigma公司)；多壁碳納米管(MWCNTs，深圳市納米港有限公司)；乙醇、H2SO4、HNO3、NaCl、NaH2PO4·2H2O、K2HPO4·3H2O均為分析純，購自天津博迪化工有限公司。其他試劑均為分析純，實驗用水均為Millipore純水系統制備。

1.2 c -MWCNTs/QW固相萃取柱的制備

1.2.1c-MWCNTs制備c -MWCNTs根據文獻方法[23]制備。稱取110 mg MWCNTs于50 mL 50%乙醇溶液中，攪拌10 min，用超純水抽濾清洗MWCNTs。過濾后置于60 mL濃H2SO4-HNO3混酸(3∶1，V/V)中，于60 ℃水浴回流5 h。過濾，用超純水洗滌至中性，過濾收集c -MWCNTs固體粉末，將其分散在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=6.0)中平衡6 h，備用。

1.2.2QW預處理首先將QW浸泡在無水乙醇中30 min，取出后在室溫下晾干，將干燥的QW立即放入15 mL濃H2SO4+5 mL H2O2混合溶液中，浸泡20 min，用超純水徹底洗凈，曬干。

1.2.3層層自組裝法制備CNTs/QW固相萃取柱在聚酯板材制成的微填充柱(內徑2.8 mm)的一端填充少量玻璃纖維后，將約30 mg QW填充入微柱中，并在另一端同樣填充少量的玻璃纖維(有效柱長大約為5 mm)。隨后將微柱聯入順序注射系統中，該系統包括一個5.0 mL的注射泵，一個6位選擇閥，一臺紫外/可見分光光度計和一個容量為5.0 mL的儲液環。以50 μL/s的流速將1.0 mL 0.2% PDDA溶液吸入儲液環，然后以5 μL/s的流速使其通過微柱后，以0.5 mL的超純水沖洗微柱。隨后將1.0 mL 0.2%的PSS溶液按照同樣的步驟負載，重復操作2次。將含有8～10 mg c -MWCNTs的適量懸濁液(大約 500 μL)引入微柱中，重復洗脫3次除去未吸附的多余c -MWCNTs。隨后將微柱聯入順序注射系統中以進行蛋白質的在線固相萃取。為便于評價包覆的碳納米管對蛋白質萃取行為的影響，分別以未經表面修飾的QW和c -MWCNTs填充兩個相似的微柱作為比較。

1.3 固相萃取蛋白質

將0.005 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=6.0)以5 μL/s的流速注入到c -MW CNTs/QW固相萃取柱中，平衡過夜。將3 000 μL樣品溶液吸入儲液環，以5 μL/s的流速經整體柱富集。用2.0 mL的超純水沖洗整體柱。再依次吸入500 μL 0.005 mol/L的PBS(pH=11.0)作為洗脫劑2，2 000 μL超純水和500 μL 0.005 mol/L的PBS(pH=8.0)作為洗脫劑1進入儲液環。以20 μL/s的流速洗脫整體柱，其中洗脫劑1和洗脫劑2分別用于洗脫Hb和Lyz，洗脫液用紫外/可見分光光度計在280 nm處在線檢測蛋白質濃度。實驗過程中應避免流通池中進入氣泡，由于空氣會產生很高的紫外吸收峰，干擾蛋白質的吸收峰，所以連接一個三通，方便沖洗流通池。

2 結果與討論

2.1 CNTs/QW固相萃取柱結構性能表征

如圖1所示，干燥的c -MWNTs粉末團聚嚴重，而c -MWNTs/QW復合材料的c -MWNTs團聚效應明顯減弱，說明將c -MWNTs負載到QW表面后，可以增大材料的比表面積，有利于c -MWNTs與目標物分子充分接觸，從而有利于吸附效率的提高。

圖1 c -MWNTs(A)、QW(B)和c -MWNTs/QW(C)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of c -MWNTs(A),QW(B) and c -MWNTs/QW(C)

圖2 c -MWNTs(a)、QW(b)和c -MWNTs/QW(c)的紅外(IR)光譜圖Fig.2 IR spectra of c -MWNTs(a),QW(b) and c -MWNTs/QW(c)

紅外光譜圖如圖2所示，在3 424 cm-1處均有較寬的吸收峰，為-O-H伸縮振動峰。圖中c -MWCNTs(曲線a)的1 621 cm-1為-C=O的伸縮振動吸收峰，1 083 cm-1為-C-OH 的彎曲振動吸收峰，2 915 cm-1為-C-H伸縮振動吸收峰。此外，比較圖QW(曲線b)和c -MWNTs/QW(曲線c)的紅外光譜發現，c -MWCNTs的加入并沒有新吸收峰生成，并且二者均在1 100～1 200 cm-1有Si-O-Si伸縮振動吸收峰，說明了是QW在c -MWNTs/QW的復合材料中占大部分質量。

2.2 固相萃取條件的優化

2.2.1介質pH及濃度的影響考察了進樣介質PBS濃度在0.005～0.20 mol/L范圍內c -MWNTs/QW固相萃取柱對Hb和Lyz萃取效率的影響。實驗結果見圖3A，當濃度低于0.025 mol/L時，Hb和Lyz都可以較好的吸附在c -MWNTs/QW固相萃取柱上，但隨著濃度的增加，吸附效率明顯降低。為使兩種蛋白質都獲得較高的吸附效果，后續實驗中均采用濃度為0.005 mol/L的PBS(pH=6.0)作為載流。

實驗采用pH=3.0～8.0的0.005 mol/L PBS配制10.0 μg/L的Hb和Lyz混合標準溶液，不同pH條件下c -MWNTs/QW對兩種堿性蛋白的吸附效果如圖3B所示。當pH=6.0時吸附效果最好，pH繼續增加時，對Hb吸附量呈明顯下降。后續實驗中選取pH=6.0的PBS為介質。

2.2.2洗脫劑pH及體積的影響考察洗脫液pH值對蛋白質洗脫效果的影響。結果如圖3C所示?？梢钥闯觯S著pH值增加，洗脫效果得到了明顯提高。可能由于Hb和Lyz的等電點分別為7.0和10.7，當洗脫液pH值大于蛋白質的等電點時，堿性蛋白質與碳納米管之間的靜電作用力減弱，蛋白質容易從吸附劑上洗脫下來。后續實驗中分別選擇pH=8.0和pH=11.0的PBS作為Hb和Lyz的洗脫劑。

考察不同洗脫體積對洗脫效果的影響，結果如圖3D所示。從圖中可以看出，增加洗脫液的體積可以明顯改善蛋白質的洗脫效果。當洗脫劑體積增加至300 μL時，洗脫效果沒有明顯增強，在保證洗脫完全的基礎上，為了盡可能縮短操作時間和增加富集倍數，在后續實驗中選擇的洗脫劑體積為250 μL。

圖3 萃取和洗脫條件對c -MWNTs/QW萃取效率的影響 Fig.3 Effect of extraction and elution conditions on the extraction efficiency of c -MWNTs/QW for proteins (A)concentration of eluent;(B)pH of medium;(C)pH of eluent;(D)volumn of eluent.

2.3 吸附容量研究

用0.005 mol/L PBS(pH=6.0)分別配制10 μ/mL的Hb和Lyz，考察達到萃取平衡所需體積及動態吸附容量。具體步驟：分別以經過0.45 μm的水相濾膜的10 μ/mL的Hb和Lyz的PBS作為流動相，以所制備的整體柱作為色譜柱，使蛋白質溶液不斷流過整體柱直至吸附飽和。整體柱上吸附蛋白質的量mprotein根據公式[15]計算，萃取、洗脫后光度法測定，然后計算c -MWNTs/QW固相萃取柱對Hb和Lyz的吸附容量分別為36.1 μg/mg和28.3 μg/mg，而c -MWNTs固相萃取柱分別為10.2 μg/mg和8.5 μg/mg，QW固相萃取柱分別為0.80 μg/mg和0.92 μg/mg。

2.4 萃取機理研究

圖5 蛋白質在c -MWNTs/QW固相萃取柱上的分離富集洗脫過程Fig.5 A typical operating process including sample loading and protein isolation from the sample matrix,with sequential elution of proteins by selection of elution conditions with Hb,Lyz and BSA as model proteins

圖6 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳譜圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of whole blood samples with and without treatment with c -MWNTs/QW Lane(M),protein marker;(A) lane 1,500 μg/mL Hb standard;lane 2,the 500-fold diluted whole blood after preconcentrated with c -MWNTs/QW.lane 3,whole blood samples without treatment(500-fold dilution).(B) lane 1,10-fold diluted egg-white solution;lane 2,350-fold diluted egg-white solution;lane 3,4 isolation of lysozyme from 350-fold diluted rude extractant;lane S,500 μg/mL Lyz standard.

以0.005 mol/L PBS(pH=6.0)為溶劑，分別配制10.0 μg/mL堿性蛋白質(Hb和NaCl)和酸性蛋白質BSA溶液，研究c -MWNTs/QW固相萃取柱對蛋白質的作用機理，結果如圖5所示。c -MWNTs/QW固相萃取柱對BSA幾乎不吸附，而對Hb和Lyz可以完全吸附，同時洗脫溶劑可以完全洗脫吸附在c -MWNTs/QW固相萃取柱上的Hb和Lyz，富集因子分別為18和28。這是由于碳納米管的等電點為3.0，在水溶液中帶負電荷，BSA(等電點為4.7)在水溶液中也帶負電荷，與碳納米管之間產生靜電斥力；而Hb和Lyz的等電點分別是7.0和10.7，在水溶液中帶正電荷，與碳納米管之間產生靜電引力，從而實現對Hb和Lyz的選擇性吸附。若吸附過程由疏水作用支配，則Hb和Lyz必須在高離子強度或pH接近其pI值的溶液條件下發生吸附，這與實驗結果不符。而且，c -MWNTs 表面含有大量羧基和羥基等親水基團，使其呈現親水性，因此c -MWNTs吸附蛋白質是基于靜電相互作用。

測試了純的QW、PDDA自組裝的QW和c -MWNTs/QW對堿性蛋白質的吸附。結果表明，在中性水溶液中QW和c -MWNTs/QW均能吸附大量的堿性蛋白質，而PDDA包覆的QW則完全不能吸附堿性蛋白質。除此之外，洗脫液可以完全洗脫吸附在c -MWNTs/QW固相萃取柱上的堿性蛋白質，但卻不能洗脫吸附在純QW上的堿性蛋白質。這些現象表明，QW表面的負電荷已被正電荷的PDDA中和，而且表面的官能團也完全被c -MWNTs層包覆，因此，堿性蛋白質和包覆的c -MWNTs之間的相互作用力可以視為吸附堿性蛋白質的主要驅動力。

2.5 固相萃取柱應用研究

2.5.1萃取系統分析性能在最優實驗條件下，用本方法分析Hb和Lyz，線性方程為：YHb=0.0171X-0.22,線性范圍0.30～15.0 μg/mL，檢出限為0.15 μg/mL;YLyz=0.0185X+0.043,線性范圍0.50～10.0 μg/mL，檢出限為0.08 μg/mL。采用10 μg/L標準溶液考察方法精密度(RSD)，Hb和Lyz的RSD分別為1.8%和0.6%，回收率分別為89.2%和90.2%。該方法準確可靠，能夠滿足復雜生物樣品中蛋白質分析要求。

2.5.2實際樣品的分析圖6A為萃取全血中血紅蛋白的電泳圖，其中泳道3為未經系統預處理的500倍稀釋的全血樣品溶液，由于濃度低導致染色不明顯。泳道2為500倍稀釋的全血樣品經過c -MWNTs/QW在線固相萃取后的洗脫液，除血紅蛋白的條帶外，其他條帶(如66.4 kDa的血清白蛋白條帶)的濃度都大大減弱了，表明該固相萃取系統可以有效地將全血樣品中的血紅蛋白與其他大部分的共存蛋白質分離。圖6B為萃取雞蛋清中溶菌酶前后的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳譜圖，其中泳道1、2分別為未經過系統預處理后5、350倍稀釋的雞蛋清樣品，泳道3、4為經c -MWNTs/QW在線固相萃取350倍稀釋的雞蛋清樣品，用洗脫劑2洗脫兩次后的收集液。雞蛋清粗提液經該萃取后，溶菌酶的條帶清晰可見，而大部分干擾蛋白質被有效去除。以上結果證實了該系統處理實際生物樣品的能力。

3 結論

本文通過層層自組裝的方法制備了c -MWNTs/QW，以血紅蛋白和溶菌酶作為對象，研究了c -MWNTs/QW固相萃取柱對蛋白質的吸附行為，并對從復雜基體樣品中分離堿性蛋白質進行了初步研究。研究結果表明，c -MWNTs/QW固相萃取柱選擇性富集分離堿性蛋白質，血紅蛋白和溶菌酶的富集倍率分別可達18和28，吸附容量分別為36.1 μg/mg和28.3 μg/mg。