非標記液晶生物傳感器檢測人類β防御素-2

蘇秀霞， 霍文靜， 欒崇林， 張 姣， 徐 佳

(1.陜西科技大學化學與化工學院,教育部輕化工助劑化學與技術重點實驗室，陜西西安 710021； 2.深圳職業技術學院應用化學與生物技術學院，廣東深圳 518088)

液晶(LCs)兼具液體的流動性和晶體的光學各向異性[1]。液晶分子的取向會因表面微小的形貌和化學結構變化而變化[2]，從而呈現出不同的光學信號。此外，液晶具有一定的光學信號放大作用[3]，當局部的液晶分子取向發生改變時，周圍液晶分子的取向也會受到影響。因此，利用液晶具有雙折射特性構建的液晶生物傳感器，具有構造簡單、成本低、無需標記，響應快速、所呈現的光學信號肉眼可觀等優點，在生物檢測方面具有潛在應用價值，目前液晶生物傳感器在生物分子的分析檢測領域已有涉及[4 - 8]。

防御素(Defensins)是廣泛存在于動植物體內的一類富含半胱氨酸的堿性陽離子多肽[9]，它能夠有效抑殺革蘭氏陰性菌、分枝桿菌、真菌等，具有廣譜抗菌活性，在哺乳動物的先天免疫中起著重要作用[10]。人類β防御素-2(HBD -2)是一種腫瘤壞死因子在人嗜中性粒細胞中的特異性化學誘導物[11]，它可以與體內病毒粒子共質化，形成寡聚體，從而降低艾滋病病毒(HIV)的感染性[12]。防御素在解決細菌耐藥問題方面有獨特的優勢，是一種具有廣泛應用前景的抗菌肽，故繼續對防御素家族的檢測方法進行研究具有重大意義。目前人類防御素的檢測方法主要有狹縫印記測定法[13]、灰度分析法[14]、放射免疫檢測法[15]、ELISA法[16,17]。然而，以上方法存在樣品預處理繁瑣，有的需要對抗原抗體進行標記，耗時長、成本高，且對操作人員要求高等問題。因此，尋求易操作、靈敏性較高、非標記、低成本的檢測防御素的方法迫在眉睫。

本文結合液晶生物傳感器無需標記等優點，利用直接免疫反應原理，提出了一種檢測HBD -2的新方法。首先在自組裝膜修飾的基底表面固定HBD -2抗體，通過免疫反應將HBD -2結合至傳感器基底表面，從而使基底表面形貌發生變化，引起液晶分子的排列取向的變化，導致光學信號發生變化，以此實現對HBD -2的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

XPL3230型透反兩用數碼偏光顯微鏡(上海光學儀器一廠)；SPI3800N/SPA400型原子力顯微鏡(日本，精工有限公司)；OCA20視頻光學接觸角(德國，Dataphysics公司)；載玻片(江蘇飛舟玻塑有限公司)；Mylar聚酯片(廣州市斯朗特電子科技有限公司)。

N,N-二甲基十八烷基(3-(三甲氧基硅丙基))氯化銨)(DMOAP)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)均購自美國Sigma-Aldrich公司；HBD -2、HBD -2抗體均購自英國Abcam公司；4-氰基-4-戊基聯苯(5CB)購自美國Instec公司；戊二醛(GA)購自國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純。水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1載玻片預處理將載玻片切割為2.5×2 cm，用新配制的Piranha溶液(H2O2∶H2SO4=3∶7)于溫度80 ℃浸泡2 h，依次用超純水、無水乙醇沖洗，以洗凈殘余酸液，N2吹干，110 ℃干燥3 h，防塵備用。

1.2.2上、下載玻片的自組裝上載玻片的DMOAP組裝：將預處理后的玻片浸入0.5%(V/V)的DMOAP水溶液中，常溫下靜置30 min，超純水沖洗干凈，N2吹干，110 ℃干燥1 h，防塵備用。下玻片的APTES/DMOAP混合組裝：將預處理后的玻片浸入3%(V/V)APTES和1%(V/V)DMOAP的乙醇溶液中，80 ℃恒溫2 h，取出后依次用無水乙醇、超純水沖洗干凈，N2吹干，110 ℃干燥1 h，防塵備用。玻片醛基化處理：將經過混合組裝的下玻片浸入2%(V/V)的GA的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.2)中，于搖床中37 ℃恒溫反應1 h，取出后依次用PBS(pH=7.2)、超純水沖洗干凈，以除去物理吸附的GA，N2吹干，4 ℃下保存，備用。

1.2.3HBD-2抗體的固定將HBD -2抗體溶解于0.01 mol/L的PBS(pH=7.2，含NaBH3CN)中，配制成不同濃度的HBD -2抗體溶液。取50 μL不同濃度的HBD -2抗體溶液滴加至醛基化的下玻片表面，37 ℃反應2 h，依次用0.01 mol/L PBS(pH=7.2)、超純水沖洗，除去未固定的HBD -2抗體分子，N2吹干，4 ℃下保存，備用。

1.2.4直接免疫反應將固定有HBD -2抗體的玻片浸入80 mmoL/L甘氨酸溶液中，37 ℃反應30 min，以封閉未反應完的醛基。然后取50 μL不同濃度的HBD -2溶液滴加至固定有HBD -2抗體的玻片上，于溫度37 ℃反應1 h，抗原抗體即可實現免疫反應，依次用0.01 mol/L PBS(pH=7.2)、超純水沖洗，除去非特異性吸附物質，N2吹干，4 ℃下保存，備用。

1.2.5液晶生物傳感器的性能分析液晶生物傳感器的特異性檢測：用甘氨酸溶液封閉未反應完的醛基后，將相同濃度的HBD -2、HBD -1(人類β防御素-1)、HBD -3(人類β防御素-3)、HNP -2(人類α防御素-2)分別滴加至固定有HBD -2抗體的玻片上，37 ℃反應1 h，依次用0.01 mol/L PBS(pH=7.2)、超純水沖洗，N2吹干，4 ℃下保存備用。液晶生物傳感器的可行性：用甘氨酸溶液封閉未反應完的醛基后，將HBD -2、HBD -1、HBD -3、HNP -2混合(混合試樣樣1，HBD -2的最終濃度為25 ng/mL)與HBD -1、HBD -3、HNP -2混合(混合試樣2)各取50 μL分別滴加至固定有HBD -2抗體的玻片上，37 ℃反應1 h，依次用0.01 mol/L PBS(pH=7.2)、超純水沖洗，N2吹干，4 ℃下保存，備用。

1.2.6液晶池的制作將處理后的上玻片與下玻片面對面組裝，兩片玻片之間用開凸型空腔的Mylar聚酯片隔開，小夾子固定除開孔方向外的其他三邊。將液晶5CB于40 ℃恒溫箱中加熱，當其變澄清透亮后，從開孔處注入，毛細管作用會使液晶充滿整個凸型空腔，自然冷卻至室溫(25 ℃)后，通過偏光顯微鏡觀察液晶膜亮度的變化。

2 結果與討論

2.1 液晶生物傳感器的檢測原理

實驗的檢測原理如圖1所示，先在經過醛基化處理的玻片表面固定HBD -2抗體，然后滴加不同濃度的HBD -2，HBD -2與HBD -2抗體特異性結合后，擾亂了液晶的取向(圖1F)，導致光學信號發生變化。當未加入HBD -2時，由于組裝的HBD -2抗體體積較小，不足以擾亂液晶的垂直取向(圖1E)，從而出現全黑的偏光顯微圖像。而當存在HBD -2時，它能夠與固定在基底表面的HBD -2抗體特異性結合，當達到一定的量時會擾亂液晶分子的有序排列，造成光學信號的改變，從而實現對HBD -2的快速無標記檢測。

圖1 液晶生物傳感器檢測HBD -2示意圖及液晶池的組裝過程Fig.1 The stepwise assembly of liquid crystal(LC) biosensor stubstrate(A) cleaned glass;(B) mixed self-assembled DMOAP/APTES/GA;(C)anti-HBD -2 immobilized;(D) the specific binding of anti-HBD -2 antibody and HBD -2;(E) Liquid crystal 5CB molecules are arranged vertically without adding HBD -2;(F) Specific binding of HBD -2 antibody to HBD -2 disrupts the vertical orientation of liquid crystal 5CB molecules.

2.2 基底表面APTES/DMOAP/GA自組裝膜比例優化

如圖2所示，當APTES/DMOAP比例較高時(25∶1，圖2A)，由于玻片上固定的DMOAP的量相對較少，不能有效誘導液晶分子垂直排列，光學信號呈現的圖像出現亮斑大且多；當APTES/DMOAP比例減小時，光學信號的成像中亮斑也逐漸減少，當兩者比等于或小于5∶1時(圖D、E、F)，光學信號的成像均為均一黑色背景。為了使基底既能誘導液晶垂直排列又能提供足夠的氨基鍵合戊二醛，繼而固定生物分子，選擇APTES/DMOAP比例為5∶1和3∶1進一步探討戊二醛的比例。

圖2 不同體積比的APTES/DMOAP基底自組裝膜制備的液晶池光學成像Fig.2 Optical images under crossed polarizers of LC cells with 5CB sandwiched between a DMOAP-coated glass slide and an APTES/DMOAP-decorated glass slidethe APTES/DMOAP ratios(V/V) are(A)25∶1;(B)20∶1;(C)10∶1;(D)5∶1;(E)3∶1;(F)1∶1.

戊二醛分子兩端均為醛基(-CHO)，其一端與基底表面裸露的氨基發生鍵合反應，另一端用于鏈接生物分子。如圖3所示，當APTES/DMOAP比例為5∶1，GA含量為3%時，光學成像中呈現較大彩色亮斑(圖3A)。當GA含量減少到2%時，圖像中亮斑減少(圖3B)；當GA含量減少到1%時，圖案呈現全黑背景(圖3C)。當APTES/DMOAP比例為3∶1，GA含量為3%時，光學成像中出現較大的彩色亮斑(圖3D)。當GA含量減少到2%時，圖案呈現全黑背景不干擾生物分子檢測(圖3E)。為了不產生干擾背景，且有足夠的醛基固定更多的HBD -2，選擇APTES/DMOAP比例為3∶1，GA含量2%(V/V)。

圖3 GA含量對液晶池光學成像的影響Fig.3 Effect of GA content on optical imaging of liquid crystalthe APTES/DMOAP ratios(V/V)are 5∶1,the GA ratios(V/V) were 3%(A);2%(B);1%(C);the APTES/DMOAP ratios(V/V)are 3∶1,the GA ratios(V/V) were 3%(D);2%(E);1%(F).

通過測量基底的水接觸角大小可以進一步確定組裝膜的性能。圖4為組裝了不同硅烷化試劑后基底表面的水接觸角示意圖。從圖中可以看出，酸處理后的玻片表面由于產生大量羥基，親水性增強，水滴在其基底表面幾乎完全鋪展；當基底表面組裝DMOAP后，由于DMOAP的長鏈會使基底表面能降低，所以疏水性明顯增強，水滴在其表面幾乎成球形，接觸角為89.6°(圖4B)；當玻片基底組裝APTES后，基底膜表面含有大量氨基，疏水性較DMOAP會有所降低，接觸角為61.2°(圖4C)；當APTES/DMOAP(3∶1)組裝后基底表面的水接觸角為72°(圖4D)，疏水性介于用DMOAP和APTES單獨組裝之間。采用APTES/DMOAP(3∶1)/2%GA組裝后基底表面的水接觸角為80.4°(圖4E)。文獻報道[18]當基底膜的水接觸角低于64°時，其表面液晶分子會從垂直取向變為傾斜或平行排列。因此，水接觸角實驗也證明了采用APTES/DMOAP(3∶1)/2%GA比例組裝的玻璃基底能有效誘導液晶分子垂直排列。

圖4 玻璃基底及其組裝后的水接觸角示意圖Fig.4 Water contact angles on different materials coated glass slides(A)Bare glass slide(Acid-treated bare glass)；(B)DMOAP;(C)APTES;(D)APTES/DMOAP(3∶1);(E)APTES/DMOAP(3∶1)/2%GA.

2.3 固定化HBD -2抗體濃度的優化

如圖5所示，隨著固定化HBD -2抗體濃度的減小，對液晶取向擾亂減小，液晶池光學成像逐漸變暗。當固定化HBD -2抗體濃度為低0.5 μg/mL時，光學成像幾乎為全黑(圖5D、5E)。由于需要足夠的抗體與抗原反應，因此選擇能夠使光學成像背景保持黑暗的最高固定化HBD -2抗體濃度0.5 μg/mL固定于基底表面。

圖5 不同濃度的固定HBD -2體制備的液晶池光學成像Fig.5 Optical images under crossed polarizers of LC cells with 5CB sandwiched between a DMOAP-coated glass slide and an APTES/DMOAP/GA-decorated glass slide with anti-HBD -2 immobilizedThe concentrations of anti-HBD -2 are(A)5.0;(B)2.0;(C)1.0;(D)0.5;(E)0.2 μg/mL.respectively.

2.4 HBD -2的檢測

HBD -2與HBD -2抗體特異性結合之后被固定于傳感基底表面，隨著HBD -2濃度的增加，液晶池光學成像逐漸變亮。如圖6所示，當HBD -2濃度為1.0 ng/mL時，光學信號呈現的圖像幾乎為全黑色(圖6F)，此時不能夠誘導液晶的取向改變。HBD -2濃度高于5.0 ng/mL(圖6A、B、C、D)，可觀測到明顯的光學圖像變化，顯示了良好的檢測靈敏度。

圖6 不同濃度的固定化HBD -2制備的液晶池光學成像Fig.6 Optical images under crossed polarizers of LC cells with 5CB sandwiched between a DMOAP-coated glass slide and an APTES/DMOAP/GA-decorated glass slide with HBD -2 immobilizedThe concentrations of HBD -2 are(A)300;(B)100;(C)50;(D)10;(E)5;(F)1 ng/mL,respectively.

2.5 液晶生物傳感器的特異性測定

為了檢驗本方法的特異性，分別考察了液晶對HBD -1、HBD -3、HNP -2的偏光信號變化(濃度均為100 ng/mL)。結果如圖7所示，HBD -2抗體與HBD -2結合后的光學圖像呈現明顯亮斑，而對照組中HBD -1(圖7B)、HBD -3(圖7C)、HNP -2(圖7D)的光學圖像中則僅有少數亮點。實驗表明，基于HBD -2抗體的液晶生物傳感器能夠特異性結合HBD -2，從而實現對HBD -2的檢測。

圖7 固定相同濃度的不同抗菌肽所制備的液晶池光學成像Fig.7 Optical images under crossed polarizers of LC cells with 5CB sandwiched between a DMOAP-coated glass slide and an APTES/DMOAP/GA-decorated glass slide with different antimicrobial proteinsThese proteins are(A)HBD -2;(B)HBD -1;(C)HBD -3;(D)HNP -2 100 ng/mL respectively.

2.6 液晶生物傳感方法的可行性

圖8 不同混合試樣所制備的液晶池光學成像Fig.8 Optical images under crossed polarizers of LC cells with 5CB sandwiched between a DMOAP-coated glass slide and an APTES/DMOAP/GA-decorated glass slide with different mixed samples(A)Mixed sample 1 consists of HBD -2,HBD -1,HBD -3,HNP -2；(B) Mixed sample 2 consists of HBD -1,HBD -3,HNP -2.

為了檢驗本方法的實際可行性，分別考察了將HBD -2、HBD -1、HBD -3、HNP -2混合(混合試樣樣1，HBD -2的最終濃度為25 ng/mL)與HBD -1、HBD -3、HNP -2混合(混合試樣2)后傳感器的偏光信號變化。結果如圖8所示，當傳感器基底固定的HBD -2抗體與含有HBD -2的混合試樣1反應后光學圖像中出較明顯的亮斑(圖8A)，而混合試樣2的光學圖像中僅有少數亮點(圖8B)。實驗表明，基于HBD -2抗體的液晶生物傳感能夠檢測混合試樣中的HBD -2，方法具有一定的實際可行性。

3 結論

本文利用液晶的雙折射特性，采用直接免疫反應原理，建立了一種檢測人類β防御素-2的非標記型液晶生物傳感器。當人類β防御素-2的含量高于5.0 ng/mL時，可觀測到明顯的光學圖像變化。本方法無需標記，易于操作，靈敏度較高，特異性好，有望用于多種類型抗菌肽的檢測中。