黃芪湯對腎臟集合管細胞ENaC活性的影響作用研究

陳駿良 王利 臧贏君 王浩

摘 要 目的：研究黃芪湯對腎集合管上皮鈉離子通道（ENaC）活性的影響，探索其治療腎病綜合征（NS）水腫的藥理機制。方法：將體外培養的小鼠腎集合管M-1細胞分為空白對照組、黃芪湯組和阿米洛利組，分別予純化的纖溶酶刺激后，以膜片鉗測定其膜電流變化。結果：纖溶酶刺激后，空白對照組的膜電流顯著增強（P<0.001），黃芪湯組和阿米洛利組的膜電流雖也有升高趨勢，但幅度均未達統計學顯著水平（P>0.05）。該兩組的膜電流增幅間無顯著差異（P>0.05），但均顯著低于空白對照組（P<0.05）。結論：黃芪湯可抑制腎集合管細胞的ENaC活性，該方治療NS水腫的藥理機制可能與此有關。

關鍵詞 黃芪湯 上皮鈉離子通道 膜片鉗

中圖分類號：R289.5； R256.51 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）03-0034-04

Study on the effect of Huangqi decoction on ENaC activity in renal collecting duct cell*

CHEN Junliang**， WANG Li， ZANG Yingjun， WANG Hao（Department of Nephrology， Putuo Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200062， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the effect of Huangqi decoction on epithelial sodium channel （ENaC） activity in renal collecting duct cell， and to explore the pharmacological mechanism of Huangqi decoction in ameliorating nephrotic edema. Methods： The cultured M-1 mouse collecting duct cells were divided into a blank control group， a Huangqi decoction group and an amiloride group. The changes of their membrane current intensity were measured by patch clamp after stimulation by purified plasmin. Results： After plasmin stimulation， the cell membrane current intensity increased significantly in the blank control group （P<0.001） and increased in the Huangqi decoction group and the amiloride group， however their changes did not reach statistically significant level in the latter two groups （P>0.05）. There were no significant differences in the increase of cell membrane current between the Huangqi decoction group and the amiloride group （P>0.05）， but they both were significantly lower than that of the blank control group （P<0.05）. Conclusion： Huangqi decoction can inhibit ENaC activity in renal collecting duct cell， which may be related to its pharmacological mechanism in ameliorating nephrotic edema.

KEy WORDS Huangqi decoction； epithelial sodium channel （ENaC）； patch clamp

水腫是腎病綜合征（nephrotic syndrome， NS）的常見臨床表現，嚴重時可危及生命。傳統觀點多用“低灌注假說”來解釋其發病機制：大量蛋白尿引起低蛋白血癥，導致血漿膠體滲透壓下降，組織間隙發生水腫[1]。但在臨床實踐中，人們發現許多現象往往與該假說相悖[2-3]，故進一步深入探索并發現了NS水腫的新型發病機制：NS時蛋白尿可通過腎內原發機制引起鈉潴留，導致有效血容量增加和水腫形成，其核心環節是腎臟集合管頂膜側的上皮鈉離子通道（epithelial sodium channel， ENaC）激活[4-5]。ENaC由α、β、γ三亞基組成，其中γ亞基含有纖溶酶的剪切位點，負責調節通道開閉[6]。NS發病時腎小球濾過膜受損，纖溶酶的前體纖溶酶原可自血循環異常濾過進入原尿，轉化為纖溶酶并通過蛋白剪切作用去除ENaC γ亞基上的抑制性肽段，從而大幅提高通道的開放率，促進鈉離子重吸收，導致水鈉潴留和水腫形成[7-8]。

黃芪湯始載于北宋楊士嬴的《仁齋直指方論》卷十七，方中黃芪益氣固表、利水消腫；茯苓利水滲濕、健脾和胃；麥門冬滋陰生津、清心除煩；五味子收斂固澀、補腎寧心；生地黃清熱生津、滋陰養血；瓜蔞根清熱潤肺、消腫排膿；炙甘草益氣補中、調和諸藥。諸藥合而成方，有益氣扶正之功，又兼具養陰之效，可治“消渴”，是臨床上治療糖尿病腎病的良方。我們在臨床實踐中發現，黃芪湯對于NS水腫也具有良好的治療效果，但其現代藥理學機制尚不明確。本研究基于體外細胞實驗，研究黃芪湯對ENaC活性的干預作用，以初步探索其利水作用的藥理機制，為改善NS水腫的臨床療效提供研究基礎和啟示。

1 對象與方法

1.1 研究對象和分組

選用M-1細胞（小鼠腎皮質集合管上皮細胞，購自美國菌種保藏中心ATCC）作為研究對象，培養于37 ℃、5% CO2環境下含有5%胎牛血清和5 mmol/L 地塞米松的DMEM：F12中。將M-1細胞分為空白對照組、黃芪湯組和阿米洛利陽性對照組，其中阿米洛利是ENaC的特異性抑制劑。開始檢測前，用胰蛋白酶分離M-1細胞并轉移至含有5 mmol/L 地塞米松的DMEM：F12中，在37 ℃、5% CO2環境下進行培養，其中黃芪湯組予1 000 mg/ml黃芪湯提取物預孵，阿米洛利組予2 μmol/L 阿米洛利（英國Abcam公司）預孵，24 h后開始檢測。三組細胞分別給予純化的纖溶酶（美國Sigma公司）刺激后，采用膜片鉗技術測定其膜電流強度變化。

1.2 含黃芪湯培養基的制備

黃芪湯方劑組成（kg）：黃芪2、茯苓2、麥門冬2、五味子1、生地黃3、瓜蔞根2和炙甘草1，共計13 kg。加4倍量水，熱回流提取2 h后過濾，擠干濾渣內水分，再重復上述提取、過濾流程2次。合并總共3次所得提取液，減壓濃縮為稠浸膏，以95%乙醇調節含醇量為70%，靜置過夜。吸取上清液，置于減壓干燥箱中，105℃下減壓干燥48 h，得干粉提取物。每克提取物相當于7.5 g處方量。稱取適量黃芪湯干粉提取物，經渦旋、超聲、水浴等方法使其充分溶解于前述培養基中，經0.22 mm濾器過濾并配制成1 000 mg/ml的溶液。

1.3 膜片鉗實驗方法

細胞內液組成：135 mmol/L 谷氨酸鉀，10 mmol/L 氯化鉀，10 mmol/L 氯化鈉，1 mmol/L氯化鎂，10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），0.3 mmol/L 三磷酸鳥苷鈉， 0.5 mmol/L 三磷酸腺苷鎂，2 mmol/L 乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）。

細胞外液組成：10 mmol/L HEPES-氫氧化鈉，140 mmol/L 氯化鈉，2.8 mmol/L氯化鉀，1 mmol/L 氯化鎂，2 mmol/L 氯化鈣，11 mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L 蔗糖。

在室溫下進行檢測，采用全細胞記錄模式。拉制、拋光微玻管電極。低通濾波頻率設為2.9 kHz，采樣頻率設為20 kHz。鉗制電位設為–60 mV，鉗制時間設為200 ms，由–60 mV向–150 mV給予10 mV步階電壓的脈沖刺激，頻率為1次/s，記錄–150 mV時的細胞膜電流。經軟件處理，計算細胞膜電流強度的變化。

用給藥系統將10 μg/ml 纖溶酶緩慢加入至待測M-1細胞附近的細胞外液中，30～60 s后重復檢測細胞膜電流，從而計算纖溶酶對M-1細胞膜電流強度的影響。每項測定均取3個不同的細胞重復進行。

1.4 統計學方法

使用PASW Statistics 18.0（IBM，美國）軟件。計量資料中符合正態分布的使用獨立樣本t檢驗，用均數±標準差表示結果；不符合正態分布的使用獨立樣本非參數檢驗，用中位數（下限，上限）表示結果。P<0.05時認為差異達到統計學顯著水平。

2 結果

采用全細胞記錄模式對M-1細胞的膜電流強度進行測定。在基線狀態下，M-1細胞膜上可測得內向電流，予纖溶酶刺激后，膜電流強度明顯升高。若予黃芪湯或阿米洛利預孵后再予纖溶酶刺激，其膜電流強度也有小幅增加，但均較預孵前明顯減弱（圖1）。

分別檢測空白對照組、黃芪湯組和阿米洛利陽性對照組的M-1細胞在加入纖溶酶前、后的膜電流強度，并計算其增幅大小。結果顯示，予纖溶酶刺激后，空白對照組的膜電流強度顯著升高（P<0.001），而黃芪湯組和阿米洛利陽性對照組的膜電流雖也有升高趨勢，但其強度變化均未達統計學顯著水平（P>0.05）。黃芪湯組和阿米洛利陽性對照組的膜電流增幅間無顯著差異（P>0.05），但均顯著低于空白對照組（P<0.05）（表1，圖2）。

3 討論

中醫理論認為水腫的形成與正氣不足、氣水失運有關。《黃帝內經》曰“氣為血帥，血為氣母，氣行則血行，氣滯則血瘀”；《金匱要略》曰“血不利則為水”。若正氣不足，氣運失調，則水液氣化不利，再加諸外邪因素，可致水液潴留，泛溢肌膚，從而形成水腫[9]。在水腫的治法上，張景岳認為“凡治腫者，必先治水，治水者必先治氣”。臨床上以益氣扶正為治法，氣行則水行，水腫自消，是中醫治療水腫的重要原則和方法。本研究中的黃芪湯具有益氣扶正之功，又兼具養陰之效，可生精化氣，氣行則水行，故有利水消腫之效。其治療NS水腫的作用符合中醫理論的相關認知，值得進一步深入研究以探索其現代藥理學作用機制。

本研究顯示，纖溶酶刺激M-1細胞后其膜電流強度可顯著增強，而若予阿米洛利預孵后再予纖溶酶刺激，膜電流強度則較預孵前明顯減弱，說明纖溶酶刺激M-1細胞所產生的膜電流可被阿米洛利——ENaC的特異性阻斷劑所抑制，證實了該膜電流主要來源于ENaC，纖溶酶對腎臟集合管細胞ENaC具有激活作用，與既往的研究結果相符[4，7]。M-1細胞予黃芪湯預孵后再予纖溶酶刺激，膜電流強度同樣較預孵前大幅下降，說明黃芪湯可顯著減弱纖溶酶對ENaC電流的刺激效應，其作用強度與陽性對照藥物阿米洛利相類似，提示黃芪湯具有對ENaC活性的強效抑制作用。ENaC受抑后腎臟集合管重吸收鈉離子減少，可減輕水鈉潴留，促進NS水腫消退，這可能是該方利水消腫作用的現代藥理學機制所在。

關于黃芪湯抑制ENaC的具體內在機制，既往研究顯示其成分之一茯苓可抑制腎臟集合管ENaC的表達水平，使NS大鼠的腹水量減少[10]，但黃芪湯整體方劑的作用機制目前尚未完全明確。ENaC的活性取決于其在腎臟集合管頂膜上的表達量和開放率。研究發現，ENaC的膜表達量與泛素通路和網格蛋白（clathrin）依賴性內吞通路有關[11]。腎臟集合管細胞中的泛素連接酶Nedd4-2可與ENaC各亞基的PPxY模體特異性結合，使ENaC發生泛素化并轉入clathrin依賴性內吞通路，在clathrin的介導下形成內體囊泡，并最終轉運至溶酶體內降解，從而下調其膜表達量[12]。在這一過程中，Epsin蛋白和磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）是聯系泛素通路和clathrin依賴性內吞通路的核心“橋梁”因子，其中PIP2還可直接結合ENaC從而影響通道開閉，對ENaC的表達量和開放率均具有調控作用。

進一步的研究發現，上述調控機制的上游影響因子是腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase， AMPK）。AMPK可使Nedd4-2發生磷酸化，增強其與ENaC間的結合作用，促使ENaC發生泛素化并經Epsin、PIP2承接轉入內吞降解通路，導致其膜表達量下降。同時AMPK也可干擾ENaC和PIP2間的結合作用，從而直接下調ENaC的開放率[13-14]。由此形成了AMPK-泛素-PIP2/clathrin通路，是引起ENaC活性下降的重要調控機制。

本科室研究團隊的前期研究發現，黃芪湯可激活AMPK[15]。由此推測，黃芪湯可通過激活AMPK-泛素-PIP2/clathrin通路以下調腎臟集合管ENaC的表達量和開放率，這可能是黃芪湯抑制ENaC活性的藥理機制所在（圖3），但尚須進一步深入研究以資明確。

本研究以膜片鉗（全細胞模式）測定了黃芪湯對腎臟集合管細胞ENaC總體活性的影響，后續研究將進一步采用Western Blot、PCR及免疫熒光測定ENaC的表達分布情況，并采用膜片鉗（外面向外模式）檢測ENaC的開放率，以進一步探索黃芪湯影響ENaC活性的具體機制。

綜上所述，本研究基于體外細胞實驗，發現黃芪湯具有對腎臟集合管細胞ENaC活性的強效抑制作用，提示該方利水作用的現代藥理學機制可能與此有關，為臨床上應用黃芪湯治療NS水腫提供了一定的研究基礎和啟示。

參考文獻

[1] Siddall EC， Radhakrishnan J. The pathophysiology of edema formation in the nephrotic syndrome[J]. Kidney Int， 2012， 82（6）： 635-642.

[2] Bistrup C， Thiesson HC， Jensen BL， et al. Reduced activity of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 is not responsible for sodium retention in nephrotic rats[J]. Acta Physiol Scand， 2005， 184（2）： 161-169.

[3] Brown EA， Markandu N， Sagnella GA， et al. Sodium retention in nephrotic syndrome is due to an intrarenal defect： evidence from steroid-induced remission[J]. Nephron， 1985， 39（4）： 290-295.

[4] Svenningsen P， Bistrup C， Friis UG， et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel[J]. J Am Soc Nephrol， 2009， 20（2）： 299-310.

[5] Teoh CW， Robinson LA， Noone D. Perspectives on edema in childhood nephrotic syndrome[J]. Am J Physiol Renal Physiol， 2015， 309（7）： F575-F582.

[6] Svenningsen P， Andersen H， Nielsen LH， et al. Urinary serine proteases and activation of ENaC in kidney--implications for physiological renal salt handling and hypertensive disorders with albuminuria[J]. Pflugers Arch， 2015， 467（3）： 531-542.

[7] Zachar RM， Skj？dt K， Marcussen N， et al. The epithelial sodium channel γ-subunit is processed proteolytically in human kidney[J]. J Am Soc Nephrol， 2015， 26（1）： 95-106.

[8] Svenningsen P， Friis UG， Versland JB， et al. Mechanisms of renal NaCl retention in proteinuric disease[J]. Acta Physiol（Oxf）， 2013， 207（3）： 536-545.

[9] 李衛國， 馬鴻斌. 中醫藥治療腎病綜合征的研究進展[J].亞太傳統醫藥， 2012， 8（2）： 166-167.

[10] Lee SM， Lee YJ， Yoon JJ， et al. Effect of poria cocos on puromycin aminonucleoside-induced nephrotic syndrome in rats[J/OL]. Evid Based Complement Alternat Med， 2014， 2014： 570420. doi： 10.1155/2014/570420.

[11] Wang H， Traub LM， Weixel KM， et al. Clathrin-mediated endocytosis of the epithelial sodium channel. Role of Epsin[J]. J Biol Chem， 2006， 281（20）： 14129-14135.

[12] Kabra R， Knight KK， Zhou R， et al. Nedd4-2 induces endocytosis and degradation of proteolytically cleaved epithelial Na+ channels[J]. J Biol Chem， 2008， 283（10）： 6033-6039.

[13] Mace OJ， Woollhead AM， Baines DL. AICAR activates AMPK and alters PIP2 association with the epithelial sodium channel ENaC to inhibit Na+ transport in H441 lung epithelial cells[J]. J Physiol， 2008， 586（18）： 4541-4557.

[14] Baines D. Kinases as Targets for ENaC Regulation[J]. Curr Mol Pharmacol， 2013， 6（1）： 50-64.

[15] 陳霞， 彭文， 曹愛麗. 黃芪湯對糖尿病腎病小鼠AMPKCamkkβ（LKB1）信號通路的影響[J]. 上海中醫藥大學學報， 2016， 30（5）： 46-50.