從檢驗學(xué)角度探討人體皮膚菌群

麗敏 宋佳春 王虎明

摘要：皮膚是一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，正常情況下，細菌群落的種類和數(shù)量存在動態(tài)平衡，菌群之間的相互抑制及促進作用維持著皮膚的正常狀態(tài)。受內(nèi)外界因素的影響，皮膚屏障功能受到破壞，表現(xiàn)為炎癥、感染等皮膚問題時，會導(dǎo)致皮膚正常菌群的失調(diào)、多樣性改變和致病菌的生長繁殖。本文介紹幾種獲得皮膚菌群的檢測手段，探討皮膚菌群之間的作用機制及影響菌群分布的影響因素，對常見皮膚問題（濕疹、痤瘡）中皮膚菌群的變化進行綜述。從多個方面了解皮膚菌群以及微生物在健康人及皮膚疾病中的重要組成及地位，利用皮膚常駐菌與致病菌之間的相互關(guān)系及作用機理抑制致病菌的生長，從而為微生態(tài)治療提供依據(jù)及用藥指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：皮膚細菌;檢測方法;菌群平衡;微生態(tài)治療

中圖分類號：R378? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.018

文章編號：1006-1959（2019）01-0053-03

Exploring Human Skin Flora from the Perspective of Testing

LI Min1，SONG Jia-chun2，WANG Hu-ming1

（1.Department of Clinical Laboratory，Baotou Cancer Hospital，Baotou 014030，Inner Mongolia，China;

2.Department of Clinical Laboratory，the Fourth Hospital of Baotou，Baotou 014030，Inner Mongolia，China）

Abstract：The skin is a complex micro-ecological system. Under normal circumstances， there is a dynamic balance between the types and numbers of bacterial communities， and the mutual inhibition and promotion between the bacteria maintains the normal state of the skin. Under the influence of internal and external factors， the skin barrier function is destroyed， which is manifested as skin problems such as inflammation and infection， which may lead to the imbalance of the normal flora of the skin， the change of diversity and the growth and reproduction of pathogenic bacteria. This paper introduces several methods for obtaining skin flora， discusses the mechanism of action between skin flora and the influencing factors affecting the distribution of bacteria， and reviews the changes of skin flora in common skin problems （eczema， acne）. Understand the important composition and status of skin flora and microorganisms in healthy people and skin diseases from various aspects， and use the mutual relationship between skin resident bacteria and pathogenic bacteria to inhibit the growth of pathogenic bacteria， thus Ecological treatment provides the basis and medication guidance.

Key words：Skin bacteria;Detection method;Flora balance;Microecological treatment

皮膚是人體最大的器官，作為主要的屏障系統(tǒng)，起著非常重要的隔離、保護作用。皮膚表面及與外界相通的腔道中存在數(shù)量龐大的細菌，皮膚一方面通過物理屏障作用阻止微生物的入侵，另一方面發(fā)揮著固有免疫和適應(yīng)性免疫的免疫屏障作用[1]，是人體重要的一道保護防線。在長期的相互適應(yīng)環(huán)境中，細菌對人體造成的“威脅”鑄就了其復(fù)雜的免疫力。可見，正常菌群是人體健康所必須的[2]。人類皮膚表面不同細菌之間存在抑制與促進的關(guān)系，這種抑制與促進的關(guān)系表現(xiàn)為細菌數(shù)量與種類存在一定程度的動態(tài)平衡[3]。當(dāng)平衡遭到破壞，將導(dǎo)致皮膚屏障功能的破壞，產(chǎn)生皮膚問題，因此皮膚微生態(tài)菌群的研究已經(jīng)成為皮膚疾病診斷、治療中的熱點問題。2007年，人類微生物組計劃在美國國立衛(wèi)生院（NIH）的帶領(lǐng)下正式啟動，通過高通量測序技術(shù)對人體皮膚、鼻腔、口腔、腸道和陰道5個不同部位的微生物群落進行分析，目的是應(yīng)用這一技術(shù)全面了解人體微生物群落的特點[4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，特別是高通量DNA測序技術(shù)的進步，人們對人體微生物菌群的研究更加深入、全面。目前，皮膚檢測手段發(fā)展到這一階段經(jīng)歷了快速的技術(shù)變革，現(xiàn)將較常用的檢測手段以及所獲得的皮膚菌群知識綜述如下。

1皮膚微生物檢測技術(shù)

微生物檢測技術(shù)是獲得微生物特征信息的手段，從傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)到最新的高通量測序平臺的建立，實現(xiàn)了對細菌有限數(shù)量到細菌微環(huán)境的檢測。細菌檢測方法正得到不斷的發(fā)展和更新，以往因技術(shù)欠缺所導(dǎo)致微觀領(lǐng)域認識不足等問題得到改觀。檢測方法的選擇要根據(jù)檢測目的、原理、成本及操作等多方面條件考慮進行選擇。

1.1傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)實驗室檢測? 以往的醫(yī)學(xué)臨床實驗室細菌檢測多采用培養(yǎng)學(xué)方法，即用人工方法將采集的標本接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基上，提供細菌生長所必須的外界條件：適宜溫度、濕度、氣體環(huán)境等，符合特定條件的細菌則能生長繁殖。該方法檢測成本低，檢測周期較長，一些生長條件要求苛刻的細菌很難在常規(guī)條件下培養(yǎng)出來。有報道稱，皮膚上近99%的細菌是不能在普通培養(yǎng)基上培養(yǎng)出來的[5]。這類培養(yǎng)的鑒定過程是通過細菌形態(tài)和生化反應(yīng)等表型鑒定方法進行的，相比于分子生物學(xué)方法，后者的鑒定結(jié)果更為可靠。

1.2 DNA測序技術(shù)? 在原核微生物中，16S rRNA基因是編碼16 rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細菌的基因組中，在結(jié)構(gòu)和功能上16S rRNA具有高度的保守性和特異性，還具有“種”間多態(tài)區(qū)[6]，因此，分析其序列可確定各種細菌的進化距離和相互關(guān)系。目前，已有上千種細菌的16S rDNA序列被測定，并載入基因庫。測序技術(shù)能夠克服傳統(tǒng)鑒定過程中生化反應(yīng)的多種局限性，對疑難細菌的鑒定尤為重要。測序技術(shù)目前已經(jīng)發(fā)展到第二代，又稱新一代測序技術(shù)，相比于第一代的優(yōu)點是能夠快速、低成本地處理幾百萬基因序列信息，這種單次運行處理海量序列數(shù)據(jù)的能力是它的突出特點，故又稱為高通量測序技術(shù)[7]。目前使用最為廣泛的3種主流測序技術(shù)有Roche/454焦磷酸測序儀、Genome Analyzer（Illumina GA）測序儀和Biosystems SOLiD基因測序儀，在基因組學(xué)中具有里程碑意義。

1.3質(zhì)譜技術(shù)? 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）是將樣品（細菌、真菌）混入基質(zhì)分子中使其形成晶體。當(dāng)用激光照射晶體時，基質(zhì)從激光中吸收能量，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，樣品電離后在電場作用下飛過真空的飛行管，通過離子的質(zhì)量電荷之比（M/Z）與離子的飛行時間成正比來分析離子，并測得樣品分子的分子量。離子質(zhì)量電荷之比（M/Z）為橫坐標，飛行時間檢測器探測到的離子峰為縱坐標，繪制質(zhì)譜圖，經(jīng)軟件與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行比較，根據(jù)特異圖譜實現(xiàn)對目標微生物屬、種及亞型的區(qū)分和鑒定[8]。該技術(shù)可將完整病原菌細胞直接檢測，但是為降低細菌樣本復(fù)雜性，需要對檢測樣本進行增殖或富集處理。該方法鑒定過程僅用10 min甚至更短時間，耗材成本較傳統(tǒng)鑒定法低3～5倍[9]。菌庫大，對常規(guī)條件下難鑒定的細菌有較好的鑒定效果。

2正常皮膚菌群

人類皮膚細菌可分為兩大類：①常居菌（Resident microorganisms）：也稱固有性細菌，是人體表面數(shù)量及種類較固定的微生物群體。在皮膚環(huán)境變化菌群受到干擾的情況下，能夠重新建立原有菌群構(gòu)成。Grice EA等從健康成人20個不同皮膚位置進行采樣，采取高通量測序手段發(fā)現(xiàn)常居菌主要分為四門：放線菌門（52%）、厚壁菌門（24%）、變形菌門（17%）和擬桿菌門（7%）[10]。主要包括：表皮葡萄球菌、需氧性孢子菌、白色念珠菌、近平滑念珠菌、糠秕孢子菌屬、類白喉桿菌屬等。②暫居菌（Transient microorganisms）：來自于外部環(huán)境，寄居在皮膚表面幾個小時到幾天后消失，不建立永久定植，這類細菌有革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、八疊球菌、鏈球菌屬等，還包括變形桿菌及腸桿菌科大腸桿菌及糞產(chǎn)檢桿菌等。宿主正常的衛(wèi)生狀況、免疫狀態(tài)、完好的皮膚屏障功能等正常狀態(tài)下，常居菌和暫居菌是不會致病的。然而，多重因素影響宿主的正常狀態(tài)時，這兩類細菌都有可能成為致病菌，增殖并引發(fā)疾病的發(fā)生。例如，表皮葡萄球菌是皮膚常居菌，在免疫力低下的患者中可能引發(fā)機會性致病。此外，一般情況下，金黃色葡萄球菌為暫居菌，在部分人群中金葡菌可成為無癥狀帶菌者的常駐微生物，同時也是重要的病原體[11]。

3影響皮膚菌群分布的因素

皮膚構(gòu)造的影響及分泌的化學(xué)物質(zhì)不同，導(dǎo)致不同個體皮膚微環(huán)境存在差異，這是皮膚菌群分布的主要影響因素。皮膚的解剖構(gòu)造，如皮溝、皮嵴等為細菌提供了一個獨特的微生態(tài)棲息場所。皮脂腺、汗腺、毛囊等皮膚附屬結(jié)構(gòu)的特殊凹陷及功能為細菌生長提供不同的物質(zhì)及環(huán)境條件。人類皮膚根據(jù)性質(zhì)不同，分為皮脂溢出部位、潮濕部位和干燥部位，這是影響皮膚菌群的一類重要因素。高通量測序顯示不同性質(zhì)皮膚表面細菌分布的種類差異很大，如正常人潮濕部位多定植革蘭氏陽性的葡萄球菌、微球菌、棒狀桿菌、丙酸桿菌等[12]。皮脂分泌旺盛部位為適合厭氧環(huán)境的親脂性丙酸桿菌和親脂性真菌馬拉色菌占優(yōu)勢[13]。干燥部位定植的細菌較為豐富，以葡萄球菌、丙酸桿菌、微球菌、棒狀桿菌、鏈球菌多見[14]。另外，影響皮膚菌群分布的其他因素有：地理因素導(dǎo)致的紫外線差異、氣候、氣溫，過量飲酒導(dǎo)致營養(yǎng)和維生素缺乏降低機體免疫力和皮膚屏障功能，個人衛(wèi)生習(xí)慣和護膚品的選擇以及同一個體不同pH值及溫度等[15]。

細菌與細菌之間存在復(fù)雜的抑制、促進的關(guān)系，這種關(guān)系在菌群多樣性的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮著重要的作用。抑制是通過競爭及拮抗作用來實現(xiàn)。微生物拮抗作用是指一種微生物在其生命活動中，產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物或改變環(huán)境條件，從而抑制其它微生物的生長繁殖，甚至殺死其它微生物的現(xiàn)象。常駐菌群能夠降低皮膚酸堿度，維持皮膚酸性環(huán)境為pH 3～5，以此抑制病原微生物的入侵和繁殖[5]，如痤瘡丙酸桿菌在某種程度上通過分解皮脂脂質(zhì)釋放脂肪酸，脂肪酸所產(chǎn)生的酸性環(huán)境不利于金黃色葡萄球菌和化膿性鏈球菌的繁殖，還能抑制耐甲氧西球菌和棒狀桿菌的生長，一定程度上抑制了致病菌的生長。表皮葡萄球菌則通過引起脂質(zhì)膜滲漏和促進宿主產(chǎn)生抗菌肽（AMPs）等機制抑制致病菌的生長[16]。丙酸桿菌和表葡作為正常菌群共同對致病菌起到抑制作用，在一定程度上控制了致病菌數(shù)量，這兩種正常菌之間為促進關(guān)系。

4常見皮膚問題中菌群變化

目前，對濕疹、痤瘡患者與正常人對比研究發(fā)現(xiàn)細菌分布構(gòu)成有所改變。濕疹是由多種內(nèi)外因素引發(fā)，以瘙癢為特征的皮膚炎癥反應(yīng)，易反復(fù)、難治愈，是一種常見的皮膚疾病。王華等研究表明[17]，濕疹患者的皮損部位金黃色葡萄球菌和馬拉色菌的定植率顯著高于正常人，并且與濕疹的滲出性炎癥的嚴重程度呈正相關(guān)。使用抗菌藥物針對性控制病原菌感染的種類和數(shù)量，能明顯消除濕疹患者的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)細菌種類在改善濕疹癥狀及治療效果中有較好的作用。痤瘡（俗稱青春痘）是最常見的皮膚病，是毛囊、皮脂腺的炎癥性疾病，在青少年中有85%的發(fā)病率。目前普遍認為這類皮膚問題與痤瘡丙酸桿菌存在密切關(guān)系。正常條件下，常駐菌痤瘡丙酸桿菌有助于皮膚健康狀態(tài)的維持，這類菌通過分解皮膚脂質(zhì)產(chǎn)生游離脂肪酸，維持了皮膚酸性pH，抑制了致病菌的繁殖。當(dāng)雄激素上升時，皮脂腺分泌旺盛，痤瘡丙酸桿菌過度增殖，通過分泌脂酶、蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等分子導(dǎo)致毛囊、皮脂腺組織破裂，誘發(fā)產(chǎn)生促炎性細胞因子和中性粒細胞趨化因子，激活經(jīng)典途徑和補體旁路替代途徑，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[18]，此時，對皮膚健康起到關(guān)鍵作用的痤瘡桿菌由于菌群結(jié)構(gòu)的變化引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致條件致病。

5展望

隨著微生物檢測技術(shù)的發(fā)展，人們對皮膚菌群研究得到更加深入的認識。皮膚表面菌群數(shù)量及多樣性有助于皮膚病的診斷和治療。目前，微生物受內(nèi)外界影響的因素得到不斷地揭示，作用機制了解還不夠全面，有待于進一步的研究。正常與異常皮膚菌群構(gòu)成做分析、對比，這一關(guān)系可以指導(dǎo)臨床應(yīng)用，一種是對病原菌進行針對性治療，使用抗生素抑制致病菌生長繁殖。另一種是在感染部位人為加入微生物制劑（益生菌）限制致病菌的繁殖，減少致病菌對機體的進一步侵害，這種治療方法為目前較為熱門的微生態(tài)療法[19]。微生態(tài)療法能夠改變皮膚菌群，促進正常菌群的恢復(fù)，對宿主產(chǎn)生有益的治療效果，能夠開發(fā)局部皮膚益生菌藥劑，幫助恢復(fù)皮膚屏障是今后皮膚微生物研究的主要方向。

參考文獻：

[1]Abbas AK，Lichtman AH.Basic immunology：functions and disorders of the immune system[J].American Journal of Epidemiology，2012，155（2）：185-186.

[2]Blum HE.The human microbiome[J].Adv Med Sci，2017，62（2）：414-420.

[3]Pflughoeft KJ，Versalovic J.Human microbiome in health and disease[J].Annu Rev Pathol，2012（7）：99-122.

[4]瞿滌，張文宏.人體微生物組研究與人類健康[J].微生物與感染，2017（01）：1.

[5]Dréno B，Araviiskaia E，Berardesca E，et al.Microbiome in healthy skin， update for dermatologists[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2016，30（12）：2038-2047.

[6]朱飛舟，陳利玉，陳漢春.16S rRNA基因序列分析法鑒定病原細菌[J].中南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2013，38（10）：1035-1041.

[7]Metzker ML.Sequencing technologies-the next generation[J].Nature Reviews Genetics，2010，11（1）：31-46.

[8]顧兵，李永軍.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在臨床微生物鑒定中的應(yīng)用及價值[J].臨床檢驗雜志，2013，31（11）：814-817.

[9]王沛，楊燕妮.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在快速檢測病原菌中的研究進展[J].臨床檢驗雜志，2013，31（09）：678-680.

[10]Grice EA，Kong HH，Renaud G，et al.A diversity profile of the human skin microbiota[J].Genome Res，2008，18（7）：1043-1050.

[11]Zeeuwen PL，Boekhorst J，van den Bogaard EH，et al.Microbiome dynamics of human epidermis following skin barrier disruption[J].Genome Biol，2012，13（11）：R101.

[12]James AG，Austin CJ，Cox DS，et al.Microbiological and biochemical origins of human axillary odour[J].FEMS Microbiol Ecol，2013，83（3）：527-540.

[13]Kong HH，Segre JA.Skin microbiome： looking back to move forward[J].J Invest Dermatol，2012，132（3 Pt 2）：933-939.

[14]Findley K，Oh J，Yang J，et al.Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin[J].Nature，2013，498（7454）：367-370.

[15]閆慧敏，姜薇.人類皮膚微生物群和皮膚疾病[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2015，29（12）：1292-1294.

[16]Shu M，Wang Y，Yu J，et al.Fermentation of Propionibacterium acnes， a commensal bacterium in the human skin microbiome， as skin probiotics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].PLoS One，2013，8（2）：e55380.

[17]王華，唐立，楊國玲，等.皮炎濕疹患者皮膚菌群的測定及其臨床意義分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22（24）：5574-5576.

[18]Muszer M，Noszczyńska M，Kasperkiewicz K，et al.Human Microbiome： When a Friend Becomes an Enemy[J].Arch Immunol Ther Exp （Warsz），2015，63（4）：287-298.

[19]Maguire M，Maguire G.The role of？microbiota， and probiotics and prebiotics in？skin？health[J].Arch Dermatol Res，2017，309（6）：411-421.