糖尿病胰島病變及胰島β細(xì)胞胰島素分泌損傷檢測(cè)的整合實(shí)驗(yàn)相關(guān)經(jīng)驗(yàn)探討

張熠霖 皇曉燕 趙瀅瀅 舒興盛 王子梅 應(yīng)穎

摘要：胰島素的生理作用及分泌調(diào)節(jié)是《內(nèi)分泌系統(tǒng)》的重點(diǎn)內(nèi)容，學(xué)生通過(guò)實(shí)驗(yàn)課的實(shí)踐操作有助于加深對(duì)理論知識(shí)的了解。本文介紹了我院傳統(tǒng)《內(nèi)分泌系統(tǒng)》胰島相關(guān)實(shí)驗(yàn)課程設(shè)置的缺點(diǎn)，及針對(duì)此進(jìn)行的整合實(shí)驗(yàn)改革的內(nèi)容及成果，并就存在的難點(diǎn)問(wèn)題做了分析與探討。

關(guān)鍵詞：內(nèi)分泌系統(tǒng);糖尿病;胰腺;β細(xì)胞;胰島素

中圖分類(lèi)號(hào)：G640;R587.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.006

文章編號(hào)：1006-1959（2019）01-0018-03

Experience in the Integration Experiment of Diabetic Islet Lesions and Islet β-cell Insulin Secretion Damage Detection

ZHANG Yi-lin，HUANG Xiao-yan，ZHAO Ying-ying，SHU Xing-sheng，WANG Zi-mei，YING Ying

（Health Science Center School of Basic Medical Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060， Guangdong，China）

Abstract：The physiological function and secretion regulation of insulin are the key contents of endocrine system. The practical operation through experimental courses will be benefit to deepen the understanding of theoretical knowledge. This article introduces the shortcomings of the traditional islet related experiments of endocrine system in our school， as well as the contents and achievements of the integrated experimental reform carried out in this regard. We also discuss and analyze the difficult problems of existence.

Key words：endocrine system， diabetes， pancreas， β cells， insulin

《內(nèi)分泌系統(tǒng)》是一門(mén)與臨床醫(yī)學(xué)息息相關(guān)的重要基礎(chǔ)課程。而胰腺相關(guān)疾病里，糖尿病是一種由諸如環(huán)境因素、遺傳因素、應(yīng)激因素等多重因素引起的慢性非傳染的代謝性疾病[1]。其發(fā)病機(jī)制是由于胰島β細(xì)胞受損而引起胰島素分泌減少、胰島素受體減少或敏感性降低的一類(lèi)自身免疫性疾病，是全人類(lèi)慢性病中的一個(gè)重大難題[2]。有研究表明，糖尿病與阿爾茨海默癥也具有一定的關(guān)聯(lián)性[3]。之前的實(shí)驗(yàn)課程設(shè)置中，在內(nèi)分泌系統(tǒng)胰島相關(guān)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)方面，基于8學(xué)時(shí)的課程要求，學(xué)生只進(jìn)行了正常小鼠胰島分離與胰島素分泌刺激兩部分實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置方面未涉及糖尿病胰島病變和胰島β細(xì)胞胰島素分泌受損的檢測(cè)，在胰島相關(guān)教學(xué)上顯得較為蒼白，極大地限制了學(xué)生對(duì)于內(nèi)分泌系統(tǒng)中胰腺常見(jiàn)疾病——糖尿病的全面了解。針對(duì)存在的問(wèn)題，我們進(jìn)行了整合實(shí)驗(yàn)改革，在同樣有限的學(xué)時(shí)內(nèi)，加入糖尿病模型鼠的實(shí)驗(yàn)組，并采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)手教學(xué)與多媒體教學(xué)相結(jié)合，深化學(xué)生對(duì)胰島素正常生理作用及分泌異常導(dǎo)致糖尿病發(fā)生發(fā)展的發(fā)病機(jī)制的全面了解。在教學(xué)實(shí)踐過(guò)程中，讓學(xué)生通過(guò)：①了解糖尿病小鼠造模;②小鼠葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)與小鼠胰島素耐量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證造模并分析;③分離小鼠胰島觀察葡萄糖糖刺激胰島素分泌情況;④胰腺組織切片染色觀察胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)或胰島素含量變化等一系列試驗(yàn)來(lái)強(qiáng)化學(xué)生對(duì)糖尿病發(fā)生發(fā)展的認(rèn)知，加強(qiáng)了理論與實(shí)踐的結(jié)合能力，促進(jìn)了教學(xué)與科研的結(jié)合，也大大提升了教學(xué)效率，對(duì)學(xué)生日后的學(xué)習(xí)理解起到良好的促進(jìn)，有利于今后的綜合發(fā)展。

1整合實(shí)驗(yàn)改革內(nèi)容

1.1課前準(zhǔn)備? 此項(xiàng)要求教師及實(shí)驗(yàn)技術(shù)助理有較好的專(zhuān)業(yè)技能和長(zhǎng)時(shí)間的準(zhǔn)備。

1.1.1糖尿病造模? 糖尿病鼠造模常規(guī)為鏈脲佐菌素STZ造模和高脂飼養(yǎng)造模。因STZ鼠造模會(huì)損傷胰島β細(xì)胞[4]，大量降低后面胰島分離所得數(shù)量，我們采取高脂造模，采用4周齡的小鼠于清潔動(dòng)物房高脂飼養(yǎng)12周。此部分由教師及實(shí)驗(yàn)員實(shí)驗(yàn)前期提前準(zhǔn)備。

1.1.2饑餓處理與試劑準(zhǔn)備? 在做胰島素耐量實(shí)驗(yàn)IPITT和口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)OGTT之前饑餓小鼠8 h，準(zhǔn)備好注射要用的胰島素溶液與葡萄糖溶液。

1.1.3制作胰腺石蠟切片及免疫熒光染色，圖片儲(chǔ)存用于多媒體教學(xué)展示? 造模成功以后，殺鼠取胰腺在多聚甲醛中固定72 h，做脫水包埋。切5 μm薄片做免疫熒光染色。免疫熒光染色法標(biāo)記insulin和DAPI，以檢測(cè)胰島素的分泌情況。將拍好的圖片制成PPT用于課堂多媒體教學(xué)的展示，使學(xué)生掌握正常及糖尿病小鼠胰島的鏡下結(jié)構(gòu)，胰島素含量及分泌的差異，觀察對(duì)理論知識(shí)的掌握。

1.1.4分離胰島[5]? 此部分由教師和學(xué)生分別完成。教師在實(shí)驗(yàn)前1 d分離胰島并過(guò)夜培養(yǎng)，為學(xué)生第2天的葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備;學(xué)生在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天練習(xí)胰島的原代分離，掌握胰島的分離方法及觀察胰島的光鏡下結(jié)構(gòu)。

1.2實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程

1.2.1第1～2學(xué)時(shí)? 胰島素調(diào)節(jié)血糖的生理作用及胰島素分泌調(diào)節(jié)檢測(cè)：①體重稱(chēng)量：稱(chēng)每只小鼠對(duì)應(yīng)體重，按編號(hào)記錄;②IPITT[6]：分對(duì)照組和糖尿病DM組，按小鼠體重注射相應(yīng)的胰島素量，測(cè)量?jī)山M小鼠胰島素耐量，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制對(duì)應(yīng)曲線圖，分析對(duì)比;③OGTT：分對(duì)照組和DM組，按小鼠體重注射對(duì)應(yīng)葡萄糖量，測(cè)兩組小鼠的糖耐量，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制對(duì)應(yīng)曲線圖，分析對(duì)比;④測(cè)空腹胰島素含量：用毛細(xì)管采眼球血100 μl，靜置20 min，5000 g離心15 min，取血液上清放-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2第3～5學(xué)時(shí)? 胰島分離及結(jié)構(gòu)觀察。顯微鏡鏡下觀察與多媒體教學(xué)相結(jié)合，觀察胰島結(jié)構(gòu)：①分離胰島：處死小鼠后給胰島點(diǎn)注射膠原酶P，消化后沉淀分離，體式顯微鏡下觀察兩組小鼠的胰島形態(tài)并作比較;②倒置熒光顯微鏡下觀察老師制備好的免疫熒光染色片子，讓學(xué)生找出胰島并觀察兩組胰島的區(qū)別;觀察對(duì)照與糖尿病組胰島素的分布和含量的變化;③多媒體播映前期教師拍攝的免疫熒光染色圖片，加深對(duì)糖尿病胰島病理改變的理解。

1.2.3第6～8學(xué)時(shí)? 葡萄糖刺激胰島素分泌檢測(cè)：挑取老師課前1 d準(zhǔn)備的數(shù)量相同，大小差異不明顯的胰島放入24孔板中，做糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)。收上清與前期實(shí)驗(yàn)收集的空腹血清，ELISA法檢測(cè)胰島素含量。

2整合實(shí)驗(yàn)所取成效

2.1加強(qiáng)學(xué)生對(duì)糖尿病胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能改變的全面了解? 通過(guò)實(shí)驗(yàn)整合后的學(xué)習(xí)，學(xué)生從以往單純片面地對(duì)正常小鼠胰島分泌情況有所了解，過(guò)渡到對(duì)正常小鼠與糖尿病小鼠的外觀形態(tài)、胰島素耐量、糖耐量、胰島形態(tài)變化、胰島素分泌情況等有了全面深刻的理解，并且因?yàn)橛辛苏Ｅc疾病小鼠的對(duì)比，使學(xué)生對(duì)生理?xiàng)l件下和糖尿病疾病條件下的胰島差異有了更加清晰明確的認(rèn)知。

2.2實(shí)踐教學(xué)與多媒體教學(xué)結(jié)合，更加生動(dòng)全面? 在8個(gè)學(xué)時(shí)有限的時(shí)間內(nèi)，通過(guò)教師充分的實(shí)驗(yàn)課前準(zhǔn)備，用多媒體展示免疫熒光染色，更加直觀生動(dòng)地展示正常鼠與糖尿病鼠胰島素的分泌差異;并且漂亮的圖片也能吸引學(xué)生的注意力，提高課堂教學(xué)效率。這種多媒體展示與他們的動(dòng)手實(shí)踐相結(jié)合，使其更為全面的了解兩種小鼠的胰島特征與差異。

2.3學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技術(shù)學(xué)習(xí)更全面? 本實(shí)驗(yàn)課程不僅涉及到以往傳統(tǒng)的胰島分離和糖刺激胰島素分泌檢測(cè)，并且結(jié)合了IPITT、OGTT、眼球毛細(xì)管取血等技術(shù)，學(xué)習(xí)了解了免疫熒光染色的相關(guān)知識(shí)，讓學(xué)生在有限的時(shí)間內(nèi)多動(dòng)手動(dòng)腦，系統(tǒng)的掌握胰島的組織學(xué)及生理、病理學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，提高動(dòng)手能力，為以后打下堅(jiān)實(shí)的科研基礎(chǔ)。

2.4加深學(xué)生對(duì)課本理論知識(shí)的理解? 課本知識(shí)相對(duì)抽象與乏味，通過(guò)實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)知識(shí)的理解結(jié)合課程過(guò)程動(dòng)手實(shí)踐相結(jié)合，使相關(guān)知識(shí)具體化、直觀化，促進(jìn)學(xué)生對(duì)知識(shí)點(diǎn)的理解記憶，并能在以后的生涯中起到一定的指示作用。

3整合實(shí)驗(yàn)的難點(diǎn)與存在問(wèn)題

3.1對(duì)授課教師和實(shí)驗(yàn)技術(shù)員要求較高? 因?yàn)檎n前準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)較多，需要授課教師與實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員花費(fèi)較多時(shí)間準(zhǔn)備，由于老鼠較多，在糖刺激分泌實(shí)驗(yàn)前1 d 分離胰島需要花費(fèi)大量的時(shí)間。尤其在老鼠造模階段更需要花費(fèi)大量時(shí)間精力。并且教師與實(shí)驗(yàn)技術(shù)員需要熟練掌握小鼠造模、小鼠毛細(xì)管眼球取血、小鼠胰腺組織的摘取固定與脫水包埋、胰島分離與胰島培養(yǎng)等技術(shù)，并需把握好饑餓處理時(shí)間，提前配制好胰島素溶液與葡萄糖溶液，保存血液上清等。這些課前準(zhǔn)備的任務(wù)過(guò)重可能也需要更多的實(shí)驗(yàn)專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員的配備。

3.2小鼠需要數(shù)量較多? 整個(gè)實(shí)驗(yàn)課程下來(lái)，不僅需要對(duì)照組老鼠，并且糖尿病鼠造模需要較多的老鼠，在做IPITT與OGTT以及眼球毛細(xì)管取血中可能會(huì)由于學(xué)生操作不當(dāng)造成老鼠死亡，以至于老鼠的消耗量上升。

3.3老鼠的飼養(yǎng)周期延長(zhǎng)? 因需要小鼠造模，所以購(gòu)買(mǎi)回來(lái)的小鼠飼養(yǎng)周期大大延長(zhǎng)，期間小鼠的飼養(yǎng)與管理難度加大，將占用大量空間，花費(fèi)更多的人力、物力。

3.4時(shí)間相對(duì)緊迫? 實(shí)驗(yàn)安排非常緊湊，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)需同時(shí)進(jìn)行，不僅對(duì)教師的全體把控提出要求，也對(duì)學(xué)生的時(shí)間控制，動(dòng)手能力，以及課前實(shí)驗(yàn)相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)的了解有一定要求，動(dòng)手能力差，不會(huì)把控時(shí)間的學(xué)生可能會(huì)在課時(shí)內(nèi)完不成完整的實(shí)驗(yàn)，需要教師，實(shí)驗(yàn)技術(shù)員在課程中引導(dǎo)與幫助。也由于時(shí)間關(guān)系，實(shí)驗(yàn)原理需要學(xué)生課前有預(yù)習(xí)，老師做適量講解以縮短課時(shí)時(shí)間的花費(fèi)。

4總結(jié)

通過(guò)對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)中與胰腺相關(guān)的組織胚胎學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)各實(shí)驗(yàn)的有效整合，盡管增加了諸多復(fù)雜性，難度系數(shù)大大上升，但其能使此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)更加全面直觀生動(dòng)，增強(qiáng)學(xué)生自主學(xué)習(xí)能力與全面動(dòng)手能力，提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)效率，即提高了教學(xué)效率與教學(xué)效果。

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