三聚氰胺分子印跡光子晶體水凝膠膜傳感器的制備及應(yīng)用

劉哲涵, 張 鑫, 梁阿新, 孫立權(quán), 羅愛芹

(北京理工大學(xué)生命學(xué)院, 北京 100081)

三聚氰胺(melamine, MEL),是一種重要的三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化工材料,廣泛應(yīng)用于塑料、木材加工、皮革制造、醫(yī)療、電氣等行業(yè)[1]。由于三聚氰胺具有高達(dá)66%的含氮量并且價(jià)格低廉,故常被不法商販添加到牛奶、奶粉等食品中提高含氮量[2],以造成高蛋白質(zhì)含量的假象,引發(fā)了一系列的食品安全問題,對(duì)人們健康造成了極大的危害和影響。三聚氰胺在進(jìn)入人體后會(huì)水解成三聚氰酸,三聚氰酸與三聚氰胺能形成不溶性的結(jié)晶復(fù)合物,從而導(dǎo)致膀胱炎、腎衰竭,嚴(yán)重甚至能導(dǎo)致尿石癥及膀胱癌[3]。傳統(tǒng)檢測(cè)牛奶中蛋白含量的凱氏定氮法只能測(cè)定氮的總量,卻并不能有效區(qū)分氮的來源和種類。現(xiàn)有的三聚氰胺分析方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[4]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)法[5,6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)(GC-MS)法[7]、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法[8-10]、表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)法[11]等。這些方法需要昂貴而精密的儀器、專門訓(xùn)練的技術(shù)人員、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、成本較高。因此,建立一種簡(jiǎn)便、快捷、低成本的檢測(cè)三聚氰胺的方法很有必要。

分子印跡技術(shù)(molecularly imprinted technique, MIT),是指以某一特定的目標(biāo)分子(模板分子、印跡分子)為模板,制備對(duì)該分子有特異選擇性識(shí)別能力的聚合物的技術(shù)[12],當(dāng)除去模板分子后,聚合物中就形成了與模板分子形狀和功能基團(tuán)空間位置相匹配的具有多重作用點(diǎn)的印跡空穴,這些印跡空穴對(duì)模板分子具有特異識(shí)別性。光子晶體是指介質(zhì)材料在空間上按照一定的周期性順序排列形成的有序結(jié)構(gòu)材料,光子晶體的這種特殊的結(jié)構(gòu)對(duì)可見光的衍射服從布拉格衍射定律[13,14],布拉格衍射峰的波長(zhǎng)受到介質(zhì)材料的折射率與晶格參數(shù)的影響,因此光子晶體可以作為傳感材料,在生物和化學(xué)傳感器方面有著很好的應(yīng)用前景[15,16]。將分子印跡技術(shù)與光子晶體結(jié)合,可以制備出同時(shí)具有二者優(yōu)點(diǎn)的材料。這種材料對(duì)目標(biāo)物分子具有特異性識(shí)別能力,同時(shí)光子晶體能夠?qū)⒎肿佑≯E聚合物同目標(biāo)分子結(jié)合的過程轉(zhuǎn)化為光學(xué)信號(hào)[17-22]的檢測(cè)。

本研究利用單分散二氧化硅(SiO2)微球垂直沉降自組裝的方法獲得蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體模板,并選擇三聚氰胺作為模板分子,甲基丙烯酸(MAA)作為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)作為交聯(lián)劑,采用后填充的方法,經(jīng)紫外光引發(fā)聚合,再利用氫氟酸將二氧化硅蛋白石模版刻蝕下來,最終制備得到具有反蛋白石結(jié)構(gòu)的分子印跡光子晶體水凝膠膜(molecularly imprinted photonic hydrogels, MIPHs),實(shí)現(xiàn)了對(duì)三聚氰胺的檢測(cè),對(duì)于食品及環(huán)境樣品中的三聚氰胺的檢測(cè)分析具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

UV-1800型紫外分光光光度計(jì)(日本SHIMADZU公司), DH-101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(天津中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司), KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司), Acquity UPLC超高壓液相色譜儀(美國沃特世科技有限公司)。

單分散二氧化硅微球(直徑260 nm,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)購自北京市通廣精細(xì)化工公司;三聚氰胺(純度99.5%)、雙氰胺(純度99.0%)、三聚氰酸(純度99.0%)、丙烯酰胺(純度99.0%)均購自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;MAA(分析純)和EGDMA(純度98%)購自北京百靈威科技有限公司;偶氮二異丁腈(AIBN,分析純)購自上海市四赫維化工有限公司;辛烷磺酸鈉(純度99%)購自上海麥克林生化科技有限公司;檸檬酸(分析純)、濃硫酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)、過氧化氫(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)、氫氟酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥40%)均購自北京化工廠;無水甲醇(分析純)和無水乙醇(分析純)均購自北京試劑化學(xué)公司;乙腈(色譜純)購自中國Amthyst Chemicals公司。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。色譜柱:COSMOSIL C18反相色譜柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm)。將載玻片裁成76 mm×8 mm×1 mm大小,并用純水超聲清洗,浸泡在H2SO4-H2O2(7∶3, v/v)混合液中24 h,后用去離子水洗滌3次,用氮?dú)獯蹈?得到親水化載玻片。將厚度約為1 mm的聚酯薄膜(PET)裁剪成75 mm×8 mm大小。

1.2 MIPHs的制備

利用垂直沉降自組裝的方法制備蛋白石結(jié)構(gòu)模板。將粒徑為260 nm的單分散SiO2微球均勻分散到無水乙醇中,配制成2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的膠體分散體系。將親水化載玻片基質(zhì)插入SiO2溶液中,采用垂直自組裝的方式,將其置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(30 ℃)。待乙醇揮發(fā)完畢,制備得到蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體模板。

將0.15 mmol三聚氰胺(19.92 mg)、14 mmol MAA(1 200 μL)、0.50 mmol EGDMA(100 μL)溶于2.0 mL甲醇-水(3∶2, v/v)中,配制成預(yù)聚液,超聲1 h使其充分混合,再通氮?dú)?0 min以除去氧氣。然后向預(yù)聚液中加入20 mg引發(fā)劑AIBN,超聲10 min,取蛋白石光子晶體模版,在表面覆蓋一層75 mm×8 mm PET,形成下層為載玻片,中間為蛋白石光子晶體模板,上層為PET的結(jié)構(gòu)。將預(yù)聚合溶液采用后填充技術(shù)均勻鋪滿膜片與光子晶體的空隙。然后在365 nm紫外燈照射下紫外引發(fā)聚合3 h。

將上述聚合得到的光子晶體膜在質(zhì)量濃度為1%的氫氟酸中浸泡12 h,去除SiO2顆粒,得到反蛋白石結(jié)構(gòu)的MIPHs。采用甲醇-乙酸(3∶2, v/v)作為洗脫劑,將MIPHs置入洗脫劑中振蕩1 h,重復(fù)此步驟3次,以充分洗脫模板分子三聚氰胺。制備得到的MIPHs在去離子水中保存?zhèn)溆谩７欠肿佑≯E光子晶體水凝膠(non-molecularly imprinted photonic crystal hydrogels, NIPHs)制備方法除在預(yù)聚液中不加三聚氰胺外,其他步驟與上述方法相同,過程見圖1。

1.3 實(shí)際樣品的制備及檢測(cè)方法

奶粉樣品提取:稱取2 g奶粉,加入6 mL去離子水充分溶解,分4次加入4 mL乙腈,同時(shí)振蕩30 s,全部加完后充分振蕩5 min,以8 000 r/min的速度離心10 min,取上清液。于50 ℃用氮?dú)獯蹈?用6 mL去離子水溶解沉淀物,得到待測(cè)溶液。

色譜條件為流動(dòng)相:乙腈-0.01 mol/L pH 3.3庚烷磺酸鈉溶液(1∶9, v/v);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):240 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10 μL。

1.4 三聚氰胺MIPHs的表征

MIPHs的形貌用掃描電鏡進(jìn)行觀測(cè)。將MIPHs分別浸入濃度為10-11～10-6mol/L的待測(cè)溶液中,待穩(wěn)定后,取出MIPHs,使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定其紫外-可見吸收光譜,并記錄最大布拉格衍射峰波長(zhǎng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIPHs的制備及檢測(cè)原理

制備蛋白石光子晶體模板是將載玻片以一定角度插入SiO2微球-乙醇膠體分散液,在微球顆粒毛細(xì)管力和乙醇蒸發(fā)所形成彎曲液面的表面張力作用下,SiO2微球會(huì)在玻璃基片上發(fā)生有序自組裝,形成規(guī)則排列的蛋白石結(jié)構(gòu)[23]。分子印跡光子晶體薄膜對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)原理符合布拉格衍射定律。三維大孔結(jié)構(gòu)的布拉格衍射方程為:

(1)

圖 2 (a)光子晶體模板與(b)MIPHs的掃描電鏡圖Fig. 2 SEM images of (a) the photonic crystal template and (b) MIPHs

2.2 MIPHs制備條件優(yōu)化

在極性環(huán)境下,以MAA為功能單體制備的水凝膠具有較好的分子識(shí)別能力及較寬的布拉格衍射峰位移,MAA可與模板分子形成較強(qiáng)的靜電相互作用和疏水相互作用,MAA可與三聚氰胺的氨基氫原子相互作用形成氫鍵。EGDMA具有較好的親水性,有利于水凝膠膜的形成。預(yù)聚液中水能夠影響聚合物的孔和表面積,水的量可能干擾氫鍵的形成和疏水相互作用,當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于10%時(shí),氫鍵發(fā)揮重要作用。當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過65%時(shí),疏水性相互作用是主要的影響[21],為了提高M(jìn)IPHs在水中的識(shí)別能力,以及考慮到三聚氰胺的溶解度,保證有足量的功能單體參與反應(yīng),確保結(jié)合位點(diǎn)充分形成,考察了制孔劑甲醇和水的體積比(7∶3, 3∶2, 1∶1, 2∶3),最終選擇甲醇-水(3∶2, v/v)為最佳致孔溶劑,此時(shí)MIPHs具有優(yōu)良的性質(zhì)。

單體與交聯(lián)劑的比例對(duì)MIPHs的三維結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度、溶脹性能具有較大影響,交聯(lián)劑EGDMA含量對(duì)MIPHs形貌影響較大。考察了功能單體和交聯(lián)劑摩爾比為20∶1, 24∶1, 28∶1, 32∶1時(shí)制備的MIPHs的形貌和傳感性能。當(dāng)交聯(lián)劑含量較少時(shí),膜的機(jī)械強(qiáng)度較差,膜易破碎,從SEM圖可以看出連接處會(huì)發(fā)生斷裂(見圖3a);若加入過多的交聯(lián)劑,膜的溶脹性能降低,表面會(huì)發(fā)生團(tuán)聚,不能形成規(guī)整的有序排布大孔結(jié)構(gòu)(見圖3c),不能獲得有效光學(xué)信號(hào)。因此確定功能單體和交聯(lián)劑最佳摩爾比為28∶1,此時(shí)制得的MIPHs形貌如圖3b所示,MIPHs具有均勻規(guī)整的三維大孔結(jié)構(gòu),且表面平整,有利于獲得重復(fù)性好且穩(wěn)定的光學(xué)信號(hào)。

圖 3 不同MAA/EGDMA物質(zhì)的量比下制得MIPHs的SEM圖Fig. 3 SEM images of MIPHs prepared using different amount of substance ratios of methacrylic acid (MAA)/ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA)Amount of substance ratios of MAA/EGDMA: (a) 24∶1; (b) 28∶1; (c) 36∶1.

圖 4 MIPHs的傳感性能及顏色變化Fig. 4 Sensing abilities and color changes of MIPHs

2.3 MIPHs對(duì)三聚氰胺及其結(jié)構(gòu)類似物的檢測(cè)

對(duì)MIPHs和NIPHs對(duì)三聚氰胺的響應(yīng)情況進(jìn)行了考察。分別將MIPHs和NIPHs浸入濃度為10-11～10-6mol/L的三聚氰胺水溶液中,測(cè)定其布拉格衍射峰變化。如圖4所示,去離子水中MIPHs衍射峰為563 nm,隨著三聚氰胺濃度增大,MIPHs衍射峰逐漸紅移,最大為608 nm,同時(shí)膜的顏色由綠變紅。當(dāng)把NIPHs浸入三聚氰胺溶液中,衍射峰位移變化不明顯。這表明三聚氰胺印跡的MIPHs對(duì)于三聚氰胺有特異性識(shí)別作用,并且可以通過顏色變化以及光學(xué)信號(hào)分析的途徑對(duì)樣品中是否含有三聚氰胺進(jìn)行快速識(shí)別定性。作為對(duì)照,NIPHs由于不含有與三聚氰胺的結(jié)合位點(diǎn),對(duì)三聚氰胺的結(jié)合為非特異性結(jié)合,結(jié)合量較少,所以在含有三聚氰胺的樣品中衍射峰位移變化很微小。采用紫外可見分光光度儀檢測(cè)衍射峰位移變化,在0.000 1 μmol/L三聚氰胺溶液中,MIPHs衍射峰即開始發(fā)生位移。若用裸眼觀測(cè),0.01 μmol/L三聚氰胺溶液可以引起表觀顏色變化(見圖4)。則此MIPHs的檢出限估算為0.01 μmol/L,因此不論是使用紫外可見分光光度儀還是僅用裸眼觀測(cè)的檢出限均低于衛(wèi)生部公告中的限量值,即嬰兒配方食品中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg,其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg[24]。

為了進(jìn)一步考察MIPHs對(duì)三聚氰胺的特異性識(shí)別能力,進(jìn)行了MIPHs的選擇性試驗(yàn)。以入雙氰胺、三聚氰酸、丙烯酰胺作為三聚氰胺的結(jié)構(gòu)類似物,將MIPHs分別浸入不同濃度的雙氰胺、三聚氰酸、丙烯酰胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液中,并測(cè)定它們布拉格衍射峰的變化,每個(gè)濃度下重復(fù)測(cè)量5次,取平均值,測(cè)量最大偏差不超過2.5 nm。從圖5可以看出,MIPHs對(duì)結(jié)構(gòu)類似物及NIPHs對(duì)三聚氰胺均無響應(yīng),這表明制備的MIPHs對(duì)三聚氰胺具有較高的選擇性和靈敏度,可以用于樣品中目標(biāo)物的特異性識(shí)別分析。

圖 5 MIPHs的選擇性(n=5)Fig. 5 Selectivities of MIPHs (n=5)DCD: dicyanamide; AM: acrylamide; CYA: cyanuric acid.

2.4 MIPHs的動(dòng)力學(xué)及重復(fù)利用性

本研究所制備的MIPHs具有三維孔洞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),有著很高的比表面積,可以為待測(cè)分子提供充分的結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)因?yàn)榭谞罱Y(jié)構(gòu)有利于分子擴(kuò)散,所以待測(cè)物質(zhì)分子可以快速、高效與選擇性識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合。如圖6a所示,在10-9mol/L的三聚氰胺水溶液中,MIPHs的最大衍射峰位置可以在45 s左右達(dá)到平衡,具有快速響應(yīng)的特性。

圖 6 MIPHs的(a)響應(yīng)速度和(b)重復(fù)性(n=5)Fig. 6 (a) Responding speeds and (b) recover abilities of MIPHs (n=5)

圖 7 MIPHs在奶樣品中的傳感性能Fig. 7 Sensing abilities of MIPHs in a milk sample

由于MIPHs是高度交聯(lián)的聚合物,具有良好的物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。MIPHs與待測(cè)分子是非共價(jià)作用結(jié)合的,可以用乙酸-甲醇(2∶3, v/v)進(jìn)行洗脫,然后在去離子水中平衡,恢復(fù)到空白狀態(tài)。試驗(yàn)對(duì)制備的MIPHs的重復(fù)利用率進(jìn)行了測(cè)試,在5次洗脫/吸附循環(huán)中,利用同一個(gè)MIPHs對(duì)10-9mol/L的三聚氰胺水溶液進(jìn)行反復(fù)測(cè)定,結(jié)果如圖6b所示,在重復(fù)使用5次后,MIPHs對(duì)三聚氰胺仍有著良好的識(shí)別能力,表明MIPHs具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性,滿足實(shí)際使用時(shí)多次實(shí)驗(yàn)分析的需要。

2.5 MIPHs在奶制品中的傳感性能

對(duì)MIPHs在奶制品中的傳感性能進(jìn)行了考察。奶制品采用上述2.3節(jié)方法進(jìn)行處理,并采用HPLC進(jìn)行分析,檢測(cè)結(jié)果表明樣品中不含三聚氰胺。MIPHs在空白奶制品溶液中無明顯響應(yīng),這表明MIPHs在奶制品中具有良好的抗干擾能力。將處理后的奶制品溶液加入三聚氰胺,使三聚氰胺濃度為0.005、0.01和0.015 μmol/L,再將MIPHs加入進(jìn)行檢測(cè),MIPHs的布拉格衍射峰逐漸紅移(見圖7),顏色由綠變紅。三聚氰胺MIPHs在奶制品中仍具有高選擇性和高靈敏度的響應(yīng)能力,這表明此傳感器具有良好的實(shí)用性能。

3 結(jié)論

本文制備了MIPHs,并作為三聚氰胺的光學(xué)傳感器,實(shí)現(xiàn)樣品中三聚氰胺快速識(shí)別分析。這種傳感器成本低廉、操作簡(jiǎn)單,并具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)快、檢測(cè)時(shí)間短的特點(diǎn),可以用于樣品中痕量三聚氰胺的快速識(shí)別,檢出限低于衛(wèi)生部[24]公告中的限量值。此外,由于MIPHs有明顯顏色變化,可對(duì)三聚氰胺進(jìn)行裸眼識(shí)別,從而快速定性檢測(cè),進(jìn)一步降低了檢測(cè)成本和操作要求,滿足對(duì)一些樣品快速定性分析的要求。制備的MIPHs還具有穩(wěn)定性高,重復(fù)利用性好的優(yōu)點(diǎn),可以作為一種有效工具用于食品中有害成分或環(huán)境污染物的快速分析檢測(cè)。