冉國敬，蔣鑫煒，黎浩儀，陳俊良，李旭升，孫建霞，白衛(wèi)濱,*

（1.暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東省食品安全分子快速檢測工程技術(shù)中心，廣東 廣州 510632；2.廣東工業(yè)大學輕工化工學院，廣東 廣州 510090）

花色苷作為一類天然色素，其不僅安全、無毒、來源廣泛，更為重要的是其具有的生物學價值。諸多研究已經(jīng)表明花色苷對多重疾病有預(yù)防作用和健康促進功效，如抗氧化[1]、抗炎[2]、保護心血管[3]、改善生殖損傷[4]等。近年來隨著對花色苷研究的逐步深入，對較高純度花色苷尤其是單體花色苷的需求也逐步增長，然而當前其售價仍舊相當昂貴，市面上也鮮有成熟的單體花色苷制品，這主要是因為富含花色苷的原料比較單一以及提取、分離和純化的成本太高。如何快速、大量、低成本地獲得高純度花色苷，尤其是單體花色苷，是目前花色苷開發(fā)應(yīng)用面臨的一個難題。

快速大量制備單體花色苷首先需要合適的原料。桑葚是為數(shù)不多的幾種花色苷含量非常豐富的漿果之一。每100 g成熟桑葚可食用部分總花色苷質(zhì)量可達185 mg[5]，遠高于眾多其他果蔬，而其作為一種種植廣泛且產(chǎn)量可觀的鮮果，又極不耐貯藏和運輸，這使得桑葚成為一種優(yōu)良的花色苷提取潛在原料。而且很多研究表明桑葚中最主要的花色苷為矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G），其含量可占到桑葚總花色苷的60%以上[6-8]，這也更加證明以桑葚作為提取原料能夠在很大程度上滿足大量制備、生產(chǎn)單體花色苷的需求。

花色苷的分離純化是獲取單體花色苷的關(guān)鍵，現(xiàn)有研究中所使用的方法基本是凝膠色譜法[9-11]、高速逆流色譜法[12]、半制備高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[13]等，但以上方法均存在單次處理量低、成本昂貴、耗時較長等不同缺點，很難在較短時間內(nèi)快速得到大量的單體花色苷，具有一定的局限性。而中壓制備液相色譜法是一種以大量制備為目的的快速色譜分離方法，其優(yōu)點主要體現(xiàn)在單次處理量大、步驟簡潔、分離高效、成本較低等方面[14-16]，不僅在中藥有效成分的快速分離和制備中應(yīng)用較廣，而且也已經(jīng)成功地被應(yīng)用于包括茶多酚中表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯單體[17]、檸檬苦素中諾米林酸-17-β-D-葡萄糖苷單體[18]、蘆薈中蘆薈苷A、蘆薈苷B和異蘆薈色苷D 3 種單體[19]以及梔子果實中京尼平苷、京尼平-龍膽雙糖苷等6 種單體[20]在內(nèi)的多種天然產(chǎn)物的分離純化中，純化得到的單體純度均可達到95%以上。

本研究擬通過中壓制備液相色譜法從桑葚中快速制得較大量C3G單體。在對桑葚中的總花色苷進行乙醇浸提、大孔樹脂初步分離后采用中壓制備液相色譜柱對粗分離產(chǎn)品進行進一步分離純化，從而制備出C3G單體，并通過HPLC和質(zhì)譜（mass spectrum，MS）進行純度及結(jié)構(gòu)確證。最終形成一種高效、簡便、成本低廉的單體花色苷制備方法，為單體花色苷的分離純化以及規(guī)模化生產(chǎn)提供良好的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚果干來源于廣東省農(nóng)業(yè)科學院，室溫保存；C3G標準品（純度≥97%） 成都曼思特生物科技有限公司；Amberlite XAD-7HP大孔吸附樹脂 美國Rohmand Haas公司；0.25～0.45?μm?C18填料 日本富士硅化學公司；甲醇（分析純） 上海泰坦科技股份有限公司；三氟乙酸（分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LE104E電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RE-52AAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海嘉鵬科技有限公司；DLSB低溫冷卻液循環(huán)泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；SB-5200DTS超聲波清洗機寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；SCIENTZ-12N真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；EZ PLUS 2000中壓制備液相色譜儀（配備二元溶劑輸送泵、紫外檢測器及自動收集器） 利穗科技（蘇州）有限公司；E2695分析型HPLC儀 美國Waters公司；8045 HPLC-MS/MS儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚花色苷粗提物的制備

稱取一定量桑葚果干，去掉蒂部并洗凈后按固液比1∶10加入體積分數(shù)65%酸化（體積分數(shù)0.1%三氟乙酸）乙醇溶液并打漿，漿液于42 ℃、200 W功率下超聲40 min后靜置12 h。采用布氏漏斗抽濾收集提取液，剩余漿體繼續(xù)加入適量上述酸化乙醇溶液并超聲浸提兩次，合并3 次提取液于42 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味后，加入1/3體積石油醚萃取，充分混合并避光靜置4 h，收集下層水相，重復操作2～3 次直至萃取完全，下層水相于35 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮除盡石油醚后收集備用。將收集到的濃縮液緩慢加入到大孔吸附樹脂柱（高100 cm、直徑12 cm）中，單次上樣體積為12 L，待其吸附后用2 倍柱體積（bed volume，BV）的0.1% HCl溶液以1 BV/h沖洗，再用體積分數(shù)80%乙醇溶液洗脫[21]。收集深色洗脫液，于42 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無醇味，再經(jīng)冷凍干燥得到桑葚花色苷粗提品。整個提取、洗脫及濃縮過程均在避光條件下進行。

1.3.2 中壓制備液相色譜柱填裝及花色苷粗品的中壓制備液相色譜分離純化

中壓制備液相色譜柱采用濕法填裝：將約1.2 kg C18填料倒入甲醇中，充分混合搖勻后緩慢倒入中壓制備色譜玻璃柱（高120 cm、寬6 cm）中，同時下端柱口連接真空泵進行減壓抽氣。待整個色譜柱填裝好后連接保護柱并繼續(xù)填裝至填料高度到達保護柱1/2處，然后采用純甲醇流動相進行柱體壓實，壓實完成后設(shè)置初始流動相條件和參數(shù)。取0.1 g花色苷粗品溶解到1 mL體積分數(shù)6%酸化（體積分數(shù)0.1%三氟乙酸）甲醇溶液中，混合均勻后上樣進行預(yù)實驗，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果調(diào)整流動相梯度、流速等重要參數(shù)，逐步增加上樣量至最大可處理量，經(jīng)過多次調(diào)整后得到的最佳參數(shù)為花色苷粗品上樣量4 g，流速36 mL/min。

取4 g桑葚花色苷粗品溶解到40 mL體積分數(shù)6%酸化（體積分數(shù)0.1%三氟乙酸）甲醇溶液中，混合均勻后上樣。體積分數(shù)0.1%三氟乙酸溶液和甲醇分別為流動相A、B，檢測波長500 nm，收集波長519 nm[22]，監(jiān)測波長280 nm和254 nm，收集閾值300 mAU，自動收集器采用多管收集方式進行洗脫液收集。按表1條件進行洗脫。

表1 中壓制備液相色譜流動相洗脫梯度及流速Table1 Gradient elution program and fl ow rate for preparative MPLC

分別收集中壓制備液相色譜分離得到的峰1～3洗脫液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮除盡甲醇后冷凍干燥，得到峰1～3的凍干粉末樣品，備用。

1.3.3 HPLC分析

1.3.3.1 C3G標準品分析

取少許C3G標準品，用甲酸、水和甲醇（體積比5∶45∶50）溶液溶解，黑暗處平衡1 h，過0.22?μm有機濾膜后進行HPLC檢測。

HPLC條件[23]如下：流動相A：5%（體積分數(shù)，下同）甲酸溶液；流動相B：5%甲酸-4 5%水-50%甲醇溶液；梯度洗脫條件：0～3 min，40%流動相B；3～27 min，40%～60%流動相B；27～32 min，60%～100%流動相B；32～40 min，100%～40%流動相B；色譜柱：Venusil ASB-C18（250 mmh4.6 mm，5?μm）；柱溫：30 ℃；流速：0～27 min，0.4 mL/min；27～32 min，0.4～0.8 mL/min；32～40 min，0.8 mL/min；檢測波長：280 nm和520 nm；進樣體積：10?μL；檢測器：光電二極管陣列（photodiode array，PDA）檢測器。

1.3.3.2 樣品分析檢測

分別取峰1～3凍干粉末樣品，用適量流動相B溶解，過0.22?μm有機濾膜后按照1.3.3.1節(jié)條件進行HPLC檢測。

1.3.4 MS分析鑒定

分別取峰1～3凍干粉末樣品，適量超純水溶解并稀釋，過0.22?μm水系濾膜后進行MS分析鑒定，具體參數(shù)如下：電噴霧離子源；離子源溫度：300 ℃；掃描范圍：m/z 200～1 000，正離子模式；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流量：10.0 L/min。

對各樣品進行Q3掃描后，選取各自豐度較高的分子離子峰進行MS/MS產(chǎn)物離子掃描，優(yōu)化電壓并分離特征離子峰，對其進行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用利穗Chromatogragh workstation 1.41軟件、Waters Empower軟件和島津LabSolutions LC-MS工作站軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷粗品的中壓制備液相色譜分離純化結(jié)果

圖1 中壓制備液相色譜分離純化花色苷粗品色譜圖Fig.1 Separation chromatograms of crude anthocyanins by preparative MPLC

在最佳參數(shù)條件下中壓制備液相色譜的分離純化效果如圖1所示，系統(tǒng)在519 nm波長處檢測到響應(yīng)閾值超過300 mAU后自動開始進行洗脫液收集，最終收集到3 個色譜分離峰所對應(yīng)的3 種洗脫液，洗脫時間分別為79～115、170～226、252～277 min，3 個峰之間分離程度較好，峰形單一，可繼續(xù)進行下一步純度和成分的鑒定工作。

2.2 HPLC分析及MS鑒定結(jié)果

圖2 C3G標準品（A）及中壓制備液相色譜峰1（B）、峰2（C）、峰3（D）HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of C3G standard (A), eluate fraction 1 (B), 2 (C) and 3 (D)

由圖2可知，峰1、2主要含有3 種物質(zhì)，分別在8.1、27.1 min和29.1 min左右出峰；峰3相對比較雜亂，主要含有4 種物質(zhì)，分別在8.1、27.1、29.1 min和35.9 min左右出峰。通過與C3G標準品的HPLC圖對比發(fā)現(xiàn)，保留時間為27.1 min的物質(zhì)與C3G標準品保留時間相對應(yīng)，從而初步判定該物質(zhì)為C3G。

圖3 中壓制備液相色譜峰1 MS掃描圖Fig.3 Mass spectrum of eluate fraction 1 by preparative MPLC

通過MS/MS掃描各峰（圖3～5）發(fā)現(xiàn)：峰1、3中組分相對雜亂，峰1主要分子離子為m/z 288.00、448.98和m/z 595.13；峰3主要分子離子為m/z 344.00、448.98和m/z 492.23；峰2中組分則較為單一，主要分子離子分別為m/z 448.98和m/z 595.03。對m/z 448.98的分子離子在15 V電壓下碰撞后進行產(chǎn)物離子掃描，由圖4B可知，碎片離子m/z 287為矢車菊素，由母離子（m/z 449）通過失去一個葡萄糖苷（m/z 162）中性碎片而形成[24]，由此判斷m/z 448.98的分子離子所代表的物質(zhì)為C3G。對m/z 595.03的分子離子在18 V電壓下碰撞后進行產(chǎn)物離子掃描，由圖4C可知，碎片離子m/z 287為矢車菊素，m/z 449為C3G，分別由母離子（m/z 595）通過失去一個蕓香糖苷（m/z 308）中性碎片和一個鼠李糖苷（m/z 146）中性碎片而形成[25]，由此判斷m/z 595.03的分子離子所代表的物質(zhì)為矢車菊素-3-蕓香糖苷（cyanidin-3-rutinoside，C3R）。對m/z 492.23的分子離子在19 V電壓下碰撞后進行產(chǎn)物離子掃描，由圖5B可知，碎片離子m/z 330為錦葵素，由母離子（m/z 492）失去一個葡萄糖苷（m/z 162）中性碎片而形成[13]，從而判斷m/z 492.23的分子離子所代表的物質(zhì)為錦葵素-3-葡萄糖苷（malvidin-3-glucoside，M3G）。結(jié)合HPLC和MS/MS分析結(jié)果最終判斷峰1、2中主要花色苷成分為C3G和C3R，峰3中主要花色苷成分為C3G和M3G。以峰2作為目的峰，通過峰面積積分法計算得到在280 nm檢測波長處峰2中C3G純度為73.56%。

圖4 中壓制備液相色譜峰2 MS/MS掃描圖Fig.4 Tandem mass spectra of eluate fraction 2 by preparative MPLC

圖5 中壓制備液相色譜峰3 MS/MS掃描圖Fig.5 Tandem mass spectra of eluate fraction 3 by preparative MPLC

由于中壓制備液相色譜系統(tǒng)收集洗脫液時采用的是多管收集方式，每管可單獨收集50 mL洗脫液，為進一步制備C3G單體，對于峰2中未完全分離的兩種花色苷嘗試采用切割法進行流分收集[26]。對峰2整個收集區(qū)域進行如圖6所示的切割分段取樣后用HPLC檢測，結(jié)果如圖7所示。隨著收集時間的延長，C3G純度和比例逐步發(fā)生變化，在280 nm波長處4 個區(qū)域中的C3G純度分別為98.72%、69.07%、66.62%和13.43%，其中1號區(qū)域C3G純度達到98%以上，經(jīng)Q3掃描發(fā)現(xiàn)1號區(qū)域組分單一，同時MS/MS也確證分子離子m/z 448.98即為C3G（圖8）。最終選取1號區(qū)域作為切割收集區(qū)，單次即可收集到650 mL（13h50 mL）溶液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和真空冷凍干燥后成功制備出C3G單體。

圖6 中壓制備液相色譜各峰對應(yīng)收集區(qū)域及取樣區(qū)段Fig.6 Fractional collection of peaks separated by preparative MPLC

圖7 峰2不同收集區(qū)域HPLC圖Fig.7 HPLC chromatograms of fractions separated from peak 2

圖8 1號收集區(qū)域MS/MS掃描圖Fig.8 Tandem mass spectra of fraction 1

3 討 論

本研究以體積分數(shù)0.1%三氟乙酸酸化的體積分數(shù)65%乙醇溶液作為提取液，采用超聲波輔助提取法提高桑葚花色苷的提取效率。由于桑葚提取液中包含部分脂溶性雜質(zhì)，使用石油醚萃取除去提取液中的色素、揮發(fā)油、脂肪酸等脂溶性成分。

實驗前根據(jù)花色苷的極性選取合適的C18填料，然后對中壓制備液相色譜柱進行填裝，一次填裝即可長時間使用，無需每次重復裝柱。在對桑葚花色苷粗品進行分離純化時，通過多次的參數(shù)條件調(diào)整，發(fā)現(xiàn)上樣量為4 g時可達到最佳分離純化效果，如果再增加上樣量則無法達到較好的分離效果。最佳條件下共得到3 個色譜分離峰，其中以峰2作為目的峰，通過HPLC和MS檢測鑒定出峰2中主要物質(zhì)為C3G和C3R，純度分別為73.56%和20.96%，峰2整體C3G純度還達不到單體標準[27]。通過查閱文獻[28]發(fā)現(xiàn)，花色苷的HPLC行為常表現(xiàn)為二糖苷出峰在一糖苷之后，而C3G和C3R這兩種單體花色苷的區(qū)別正好在于此，本研究中的HPLC出峰結(jié)果也與之相符。實驗中也曾通過繼續(xù)優(yōu)化條件來嘗試將二者完全分離，但未能到達預(yù)期效果。而由于中壓制備液相色譜收集洗脫液時使用多管收集方式，非常適合采用切割法對峰2進行分段流分收集，最終經(jīng)檢測鑒定后切割收集區(qū)的C3G純度達到98.72%，成功制備出C3G單體。此外，除了得到目標單體，峰1、3也可作為副產(chǎn)物收集后用于進一步純化得到其他單體物質(zhì)。

相較于其他純化制備技術(shù)，中壓制備液相色譜不僅在處理量及處理效率上要優(yōu)于高速逆流色譜、半制備HPLC、柱層析等方法，而且也同樣能制得高純度的單體花色苷。高速逆流色譜純化0.1 g粗品需250 min，可得純度為98.1%的C3G單體[29]；半制備HPLC雖然能在20 min內(nèi)純化得到2?種純度均高于98%的單體花色苷，但是其單次最佳處理量只能達到0.035 g[30]；硅膠柱層析法平均純化0.275 g粗品需要300 min，所得兩種單體花色苷純度均只能達到82%以上[31]；而本研究中所使用的中壓制備液相色譜法能在320 min內(nèi)純化4 g粗品，所制得的C3G單體純度可達到98.72%。同時，中壓制備液相色譜流動相只需使用分析純試劑，且只用到甲醇一種有機試劑，后期通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即可除去，整個方法綠色、經(jīng)濟、簡潔，能夠在1 d內(nèi)連續(xù)處理8～12 g粗品，每天可截取收集到1 300～1 950 mL C3G單體溶液，經(jīng)濃縮和干燥即得到C3G單體。在C3G單體的大量制備以及更大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)上都具有很大的開發(fā)空間。

4 結(jié) 論

以桑葚作為原料，采用超聲波輔助酸化乙醇浸提法提取花色苷，通過石油醚萃取及大孔樹脂吸附除雜后使用中壓制備液相色譜分離純化花色苷粗品，并利用HPLC和MS技術(shù)對各峰物質(zhì)進行鑒定。結(jié)果顯示：桑葚中主要花色苷成分為C3G、C3R和M3G，目的峰（峰2）整體C3G純度為73.56%，對峰2進一步采用切割方式收集后C3G純度上升到98.72%。單次上樣量達4 g，可切割收集到650 mL洗脫液，經(jīng)濃縮凍干即得C3G單體，本方法處理量大、簡便易行、綠色高效，在花色苷單體的大量制備及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)上具有應(yīng)用前景。