REST在宮頸鱗狀細胞癌組織中表達及其對KCa3.1的影響

李小芳，高蘭陽，詹平，毛熙光

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州 646000)

宮頸癌是最常見的生殖道惡性腫瘤，其發病率居女性惡性腫瘤的第二位，僅次于乳腺癌[1]。宮頸癌的發生與某些離子通道的活性或表達改變密切相關。中電導鈣激活鉀離子通道(KCa3.1)在多種腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用[2]。前期研究發現KCa3.1在宮頸癌細胞增殖和侵襲中發揮重要作用[3～5]。抑制元件l沉默轉錄因子 (REST)又稱神經元限制性沉默因子，其不僅有調控神經元發生和分化的功能，還有參與轉綠調控、腫瘤形成等作用[6]。REST在非神經系統腫瘤細胞中發揮腫瘤抑制作用[7]。相關研究顯示REST在小細胞肺癌、乳腺癌、結腸癌中低表達或缺失[8～10]。Yu 等[11]研究發現，REST的細胞質轉位可能與肝腫瘤發生有關。KCa3.1啟動子區含有2個串聯的RE1位點，REST結合在這2個位點上，負調控 KCa3.1的表達[12，13]。相關研究證實KCa3.1基因表達量上升增強KCa3.1鉀離子通道的活性，促進癌細胞增殖、侵襲和轉移等生物特性[14，15]，研究發現KCa3.1在宮頸癌癌細胞增殖和侵襲中有重要作用，尚未有關在宮頸鱗狀細胞癌組織中REST是否通過結合KCa3.1啟動子RE1位點負調控KCa3.1表達的報道。2018年4～12月，我們檢測了REST在宮頸鱗狀細胞癌組織中表達，并探討其對KCa3.1的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2017年1～12月我院宮頸鱗狀細胞癌術后石蠟標本30例份，患者年齡36～51歲，中位年齡43歲，癌旁組織(距離癌組織2 cm)20例份(病理學證實不存在腫瘤)，選同期子宮肌瘤或子宮腺肌癥全子宮切除的正常宮頸組織20例份用于免疫組化。選取同期我院婦科手術切除的宮頸鱗狀細胞癌標本30例份，癌旁組織20例份，正常宮頸組織標本20例份，手術切除標本立即放入-80 ℃冰箱中保存用于qRT-PCR檢測。選取同期手術切除宮頸鱗狀細胞癌標本5例份，癌旁組織5例份，正常宮頸組織5例份，手術切除標本立即放入液氮中保存用于染色質免疫共沉淀技術(ChIP)-qPCR 檢測，上述組織標本均經病理學確診，術前未行放療、化療、生物治療或免疫治療的原發腫瘤。

1.2 REST基因在不同組織中表達量分析 利用數據庫NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、UCSC (http://genome.ucsc.edu/)、 ensemble(http://asia.ensembl.org/index.html)、Gene Cards(https://www.genecards.org/)查閱REST的表達情況，對已有數據進行分析整理。結果REST 在正常非神經細胞中高表達，在分化成熟的神經細胞中低表達，在正常宮頸組織中高表達。

1.3 REST蛋白在不同宮頸組織中的表達檢測 采用免疫組化法。石蠟標本切片，切片厚度4 μm，采用免疫組化SP法，一抗 REST工作濃度為1∶100，以PBS代替一抗染色作為陰性對照，DAB顯色。結果判定：以胞質和胞核中出現棕黃色顆粒或棕褐色顆粒為陽性。每例均隨機觀察5個高倍視野(×400)，用半定量積分法判斷，將陽性細胞所占的百分比分值和染色強度分值相乘為結果：0～2為陰性，3及以上為陽性。

1.4 REST、KCa3.1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。取100 mg凍存組織，放入盛有液氮的研缽中研磨，TRIzol試劑提取總mRNA。nanodrop測定并計算mRNA的濃度和純度，同時進行1%變性瓊脂糖凝膠電泳評估mRNA 的完整性。應用RT-PCR試劑盒將合格的mRNA 樣品反轉錄成cDNA，以cDNA 為模板進行PCR擴增。反應體系為20 μL。引物和探針通過Premier 5.0軟件設計，由上海英駿生物技術有限公司合成。REST正向引物：5′-AGTGAAAGGGCACGGAAGG-3′；反向引物：5′-TGGCAGTGGTGGTGATGG-3′，擴增片段長度123 bp。KCa3.1正向引物:5′-CAGCATCGGCGCTCTCAATC-3′；反向引物：5′-GGCAGCGGACTCCTTCATCT-3′;擴增片段長度409 bp。內參GAPDH正向引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′；反向引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，擴增片段長度225 bp。反應條件：95 ℃ 5 min 預變性；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，共40個循環。以 2-ΔΔCt法計算REST mRNA 的相對表達量。

1.5 REST在KCa3.1啟動區富集檢測 用REST的抗體進行ChIP實驗。取150 mg組織冰上剪碎，37%的甲醛 37 ℃孵育15 min使蛋白質和DNA發生交聯。甘氨酸終止交聯。4 ℃，1 200 g離心5 min，收集組織沉淀，Dounce勻漿器研磨處理。加入1 mL細胞裂解緩沖液冰上孵育10 min，4℃，1 200 g離心5 min，收集組織沉淀。加入1 mL細胞核裂解液，冰上超聲：SONOPUIS MIMI120，25%功率，10 s沖擊，30 s間隙，共20次。21 000 g 4 ℃離心 10 min，取上清，每50 μL分裝一管。取10 μL DNA溶液進行1%瓊脂糖凝膠電泳以確定DNA片段大小。超聲破碎產物加入450 μL ChIP緩沖液，取 10 μL (2 %)樣品做為"input"。加入2 μg一抗，在陰性對照中加入相應的兔IgG，加入 30 μL 蛋白G磁珠，4 ℃顛轉混勻過夜。磁架吸附蛋白G磁珠，分別用低鹽漂洗液、高鹽漂洗液清洗。連同"input"每 EP 管各加入150 μL 1×ChIP緩沖液，65 ℃振蕩孵育30 min。磁架吸附 protein G磁珠轉移上清。加入2 μL蛋白酶K 65 ℃振蕩孵育2 h。離心柱純化DNA。進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 REST與 KCa3.1 啟動子結合情況分析 采用ChIP-qPCR法。取純化后DNA，以KCa3.1啟動子區RE1位點設計引物，qPCR 進行定量分析REST與 KCa3.1 啟動子結合情況。反應體系20 μL；RE1正向引物：5′-ACATACAACCTTGCCCCTTC-3′；反向引物:5′-GTCTTTTGTCCTCCGTTAGTTG-3′。反應條件：95 ℃ 3 min 預變性；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，共 40個循環。以 2-ΔΔCt分析PCR結果。

2 結果

2.1 REST在不同宮頸組織中的表達比較 REST蛋白陽性反應主要定位于細胞質和細胞核。在正常宮頸組織和癌旁組織中均檢測到REST蛋白不同程度的表達，陽性率為100%，宮頸鱗狀細胞癌組織中REST蛋白的陽性率為40%。

2.2 不同組織中REST與KCa3.1 基因表達量 宮頸鱗狀細胞癌、癌旁、正常宮頸組織中REST基因相對表達量分別為0.46±0.06、0.89±0.13、1±0.12；宮頸鱗狀細胞癌中REST基因相對表達量較癌旁組織和正常宮頸組織分別下降48%、54%；宮頸鱗狀細胞癌、癌旁、正常宮頸組織中KCa3.1 基因表達量分別為2.14±0.35、1.18±0.21、1±0.13，宮頸鱗狀細胞癌中KCa3.1 基因表達量較癌旁組織和正常宮頸組織分別上升81%、114%。REST表達量在宮頸鱗狀細胞癌中較癌旁組織及正常宮頸組織降低(P<0.05)，KCa3.1表達量在宮頸鱗狀細胞癌中較癌旁組織及正常宮頸組織增加(P<0.05)。

2.3 REST在KCa3.1啟動區富集及REST與KCa3.1 啟動子結合情況 純化后DNA與DNA marker進行1%瓊脂糖凝膠電泳，不同組織超聲處理后，DNA片段化，大部分DNA已剪切至200～2000 bp長度，如圖1所示。REST在正常組織和癌旁組織中富集量明顯高于宮頸鱗狀細胞癌組織，如圖2。REST與 KCa3.1 啟動子結合情況見圖3。REST能結合在相應位點，REST在宮頸鱗狀細胞癌組織中的富集量比正常宮頸組織下降約60.1%，REST 在宮頸鱗狀細胞癌中富集量低于正常宮頸組織和癌旁組織(P均<0.05)。

注：NC為正常宮頸組織，AT為癌旁組織，CC為宮頸鱗狀細胞癌組織。

圖1不同組織超聲處理后1%瓊脂糖凝膠電泳

注：NC為正常宮頸組織，AT為癌旁組織，CC為宮頸鱗狀細胞癌組織，IgG為陰性對照。

圖2REST抗體進行ChIP檢測結果

注：NC為正常宮頸組織，AT為癌旁組織，CC為宮頸鱗狀細胞癌組織，IgG為陰性對照。

圖3qPCR檢測不同組織中REST蛋白富集在KCa3.1啟動子區的表達量

3 討論

宮頸鱗狀細胞癌是宮頸癌最常見的病理類型[1]。在腫瘤的發生、惡變及轉移等過程中，離子通道起重要作用。KCa3.1 是鈣激活鉀通道家族中的一員，由細胞內Ca2+水平高而激活，可促使K+外流，進而調節細胞膜電位和細胞內鈣信號，參與細胞周期的調節和細胞增殖、遷移及浸潤[16]，在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉移中發揮重要作用[2]。

REST是一種基因沉默轉錄因子，在非神經元細胞和未成熟的神經細胞中表達。REST全長1 069個氨基酸，氨基端鋅指構成REST的DNA結合結構域，可與目標基因調節區域中的抑制元1(REl)位點結合而調控基因轉錄，REST 的異常表達與多種疾病的發生相關，包括腦缺血、神經退行性疾病、癲癇、腫瘤等[6]。不同類型腫瘤中，REST有不同的作用。正常生理狀況下，REST 在非神經細胞中高表達，在分化成熟的神經細胞中幾乎不表達或表達量很低。在神經系統腫瘤中REST 表達升高，在非神經系統腫瘤中REST 表達量降低。本研究結果顯示，REST在宮頸鱗狀細胞癌組織中較正常宮頸組織和癌旁組織中顯著降低，提示REST表達降低與宮頸鱗狀細胞癌的發生密切相關。

本研究結果顯示，宮頸癌組織中 KCa3.1 mRNA的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織；KCa3.1的表達量在宮頸鱗狀細胞癌組織中較癌旁組織及正常宮頸組織增加差異有統計學意義。結合前期研究結果與實驗結果提示在宮頸鱗狀細胞癌中REST表達與KCa3.1表達相關。

文獻報道KCa3.1啟動子區含有 2 個串聯的 RE1 位點，REST 結合在這兩個位點上，負調控 KCa3.1 的表達[13，14]。本研究結果顯示，REST能結合在KCa3.1啟動子區含有的RE1位點，且REST在宮頸鱗狀細胞癌中富集的量較正常宮頸組織和癌旁組織中顯著降低。結果提示REST蛋白在宮頸組織中通過與KCa3.1啟動子RE1 位點處結合，在正常組織中抑制KCa3.1表達；當REST下調，富集在KCa3.1 啟動子區減少，降低了對KCa3.1基因表達的抑制，導致KCa3.1表達上升，從而激活KCa3.1 參與的細胞周期和細胞增殖調控通路，促進宮頸鱗狀細胞癌的發生發展。