高效液相色譜法測定人血漿中阿托伐他汀的濃度

封永莉，歐亞青，邊 原，張麗娟，陳 岷，陳 璐，童榮生

(1.電子科技大學醫學院，個體化藥物治療四川省重點實驗室，四川 成都 610072；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院藥學部，四川 成都 610072)

阿托伐他汀為臨床廣泛使用的降脂藥，口服吸收快，在肝細胞中代謝，通過抑制羥甲基戊二酰輔酶 A還原酶(HMG-CoA)而發揮藥理作用，可以減少內源性膽固醇在肝臟的合成，從而降低總膽固醇及外周血中的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，同時阿托伐他汀還具有穩定斑塊的作用。臨床上，阿托伐他汀主要用于治療高膽固醇血癥、冠心病、外周動脈粥樣硬化疾病[1]。有文獻顯示阿托伐他汀的代謝過程易受細胞色素P450(CYP)3 A4和有機陰離子轉運多肽(OATP)C和P-糖蛋白的影響，加之首過效應明顯，臨床實際應用療效差異較大，可見不良反應[2]。臨床上使用阿托伐他汀發生的不良反應以胃腸消化系統和骨骼肌肉系統受損為主，如惡心、肝酶的升高、橫紋肌溶解等[3]，針對患者可能存在的高危風險因素(如肝損、高齡、體型瘦小、甲狀腺功能減退、合并使用具有相互作用藥物等情況)，有必要通過監測阿托伐他汀血藥濃度，結合藥動藥效學理論，以建立適當的劑量方案，減少不良反應并維持降脂效果[4]。故本實驗建立一種簡便快捷的高效液相色譜法(HPLC)測定人血漿中阿托伐他汀的濃度，以用于下一步阿托伐他汀特殊人群藥代動力學研究，對給出臨床個體化用藥方案具有重要意義。

1 材料

1.1儀器Waters 2690高效液相色譜儀(美國Waters 公司)、BP211D電子天平(德國Sartori μs公司)、優普UPR-II-5 T超純水器(成都超純科技有限公司)、高速離心機320R(德國Hettich公司)。

1.2試劑阿托伐他汀(Solarbio公司，批號：308A021，含量≥98%，標準品)、醋酸銨(科密歐公司，含量≥98.0%)、冰醋酸(諾爾施，含量99.5%)、乙腈(Fisher公司，含量99.97%)、甲醇(Dikma公司，含量99.9%)，使用溶劑均為色譜級。

2 方法與結果

2.1色譜條件采用Aglient Eclipse HPLC色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相條件：乙腈：0.02 mol/L醋酸銨緩沖溶液(冰醋酸調至pH=5.2)=40：60；柱溫：30 ℃，流速：1 ml/min；進樣量：20 μl；檢測波長：245 nm。

2.2溶液配制精密稱取阿托伐他汀標準品適量，用甲醇∶水(90∶10)的溶劑定容于10 ml的容量瓶，即得1.445 mg/ml阿托伐他汀貯備液。從貯備液中取1 ml，用上述溶劑定容于10 ml的容量瓶，即得144.5 μg/ml的阿托伐他汀工作液，放入4 ℃冰箱保存。

2.3樣品處理取阿托伐他汀工作液20 μl，加入200 μl血漿，渦旋1 min后加入乙腈400 μl，渦旋3 min，14000 r/min離心7 min，取上清液進樣。

2.4方法的專一性考察阿托伐他汀標準溶液后，取空白血漿和含阿托伐他汀的血漿樣品及某病人血漿，按照“2.3”項下方法處理，進樣檢測記錄色譜圖，結果見圖1。阿托伐他汀出峰時間為7.5 min，此時檢測專一性好，與生物內源性物質分離，無雜質干擾，且色譜峰型對稱。

圖1 阿托伐他汀色譜圖 a：阿托伐他汀標準溶液；b：空白血漿；c：阿托伐他汀的血漿；d：某病人血漿

2.5線性關系考察取阿托伐他汀144.5 μg/ml工作液20 μl，用甲醇∶水(90∶10)的溶劑依次等比例稀釋后，取適量加入血漿樣本200 μl，得系列濃度為14.45、8.76、5.20、3.13、1.87、1.12、0.67、0.41 μg/ml的血漿樣品，按照“2.3”項下方法處理后。以阿托伐他汀的質量濃度(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標，計算回歸直線(采用加權最小二乘法)，得到回歸直線方程為Y=1.54×104X-5130(R2=0.9993)，表明阿托伐他汀在0.41～14.45 μg/ml范圍內線性關系良好，定量限為0.41 μg/ml。

2.6準確度與精密度取適量阿托伐他汀工作液，加入適量空白血漿得到0.64、3.03、12.89 μg/ml低、中、高濃度的阿托伐他汀血漿質控樣品，按照“2.3”項下方法處理后，每日每個濃度連續進樣6 份，連續測定3 d，用當日制得隨行標準曲線計算各濃度值，考察準確度和精密度。結果如表1，阿托伐他汀血漿質控樣品日內和日間的RSD 均小于10% (n=6)。

表1 精密度與準確度(n = 6)

2.7提取回收率

2.7.1相對提取回收率 將配制好的0.64、3.03、12.89 μg/ml低、中、高濃度的阿托伐他汀血漿樣品，按照“2.3”項下方法處理后，每個濃度連續進樣6 份，測定得峰面積A；另取空白血漿200 μl，按照“2.3”項下方法處理后，加入適量阿托伐他汀工作液，制成質量濃度為0.64、3.03、12.89 μg/ml的低、中、高濃度的阿托伐他汀血漿樣品，每個濃度連續進樣6 份，測定得峰面積B；用A/B的值表示相對提取回收率。結果可見表2，符合中國藥典生物樣品分析方法的要求。

2.7.2絕對提取回收率 另取阿托伐他汀工作液，加入流動相(乙腈：0.02 mol/L 醋酸銨緩沖溶液(冰醋酸調pH=5.2)=40：60)溶液稀釋至質量濃度為0.64、3.03、12.89 μg/ml的低、中、高濃度的阿托伐他汀溶液，每個濃度連續進樣6 份，測定得峰面積C；用A/C的值表示絕對提取回收率，見表2。符合中國藥典生物樣品分析方法的要求。

表2 提取回收率(n = 6)

2.8殘留效應在高濃度質控樣品進樣后，再以空白血漿進樣，考察殘留效應。結果顯示，空白血漿中無阿托伐他汀響應出現。

2.9穩定性考察阿托伐他汀工作液在1、2、3、5、7 d的穩定性，考察含有低、中、高濃度的阿托伐他汀血漿樣品在室溫放置4 h、4 ℃冰箱保存1、2、3、5、7 d 及反復凍融3次的穩定性，每時按照“2.3”項下方法處理，每個濃度連續進樣6 份，測定其濃度用以評價該方法的穩定性。結果顯示，上述條件下的RSD 均小于10%，符合生物樣品分析方法要求。

3 討論

阿托伐他汀具親脂性，易溶于甲醇、乙醇，極微溶于水，故本實驗選用甲醇∶水(90∶10)的比例溶液作為溶劑，阿托伐他汀在該溶液保存下溶解性及穩定性均良好。由于阿托伐他汀含有開環羥基酸結構，故顯弱酸性，其對pH敏感，有文獻顯示他汀類藥物及其代謝產物易發生內脂結構和開環結構的互變現象，pH>6時促進離子形式下的互變現象，相反，pH降低時促進非離子形式下的互變現象[5]，所以液相條件摸索的關鍵在于確定流動相的pH值，大多文獻采用流動相pH在4～5.5范圍內，并多用到甲酸銨、醋酸銨溶液[6～9]。還有文獻指出阿托伐他汀甲醇中的穩定性比乙腈低[10]。為了尋找合適的流動相比例及pH值，該實驗在摸索過程中擴大比較了pH在3.5～7.5范圍內的水相條件，以及乙腈比例在35%～60%范圍內阿托伐他汀的保留時間及峰型，實驗發現pH值增高和/或乙腈比例提高都能夠顯著地減少保留時間，最終本實驗采用Aglient 的中等長度色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，在流動相比例為乙腈：0.02 mol/L 醋酸銨緩沖溶液(冰醋酸調pH=5.2)= 40∶60條件下進行，用冰醋酸調低pH值是為了有效抑制阿托伐他汀的解離，使其更多以分子形式存在，這將有助于阿托伐他汀與內源性物質區分并且峰對稱性好，無拖尾，基線無干擾，保留時間為7.5 min，也利于臨床快速開展監測。該實驗使用的高效液相色譜法連接的是紫外檢測器，通過觀察阿托伐他汀在保留時間范圍內的全波長掃描結果，發現檢測波長為245 nm時阿托伐他汀響應最大，故采用245 nm作為檢測波長。此外，為了建立簡便快速的樣本前處理方法，本實驗比較了甲醇、乙腈直接沉淀法和二氯甲烷、乙酸乙酯液-液萃取等多種處理方法，發現相比復雜的萃取過程，單純使用1：2比例的乙腈沉淀蛋白，既能去除內源性物質的干擾，又簡便、快速、準確，可用于日常阿托伐他汀的血藥濃度監測。該方法采人血漿量少，專一性強，簡便快捷，適用推廣于阿托伐他汀特殊人群血藥濃度監測、藥代動力學及其相關性研究。