利用SELDI-TOF-MS快速鑒定鮑曼不動桿菌的研究

解春寶，羅江蓉，黃文芳，傳良敏，喻 華，楊永長，姜 偉，鐘 敏，肖代雯

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院 a.檢驗科，b.急診科，四川 成都 610072)

鮑曼不動桿菌是一種非發酵的革蘭陰性條件致病菌，存在于正常人的皮膚、呼吸道和泌尿道，也廣泛分布于水及土壤。鮑曼不動桿菌具有強大的獲得耐藥性和克隆傳播的能力，是引起醫院內患者感染的最主要細菌[1]。該菌可引起身體各種組織或器官部位的感染，導致的疾病有軟組織感染肺炎、菌血癥、腦膜炎和尿路感染等[2]。鮑曼不動桿菌在全世界范圍內備受關注。目前臨床使用的傳統細菌培養和基于生化反應來鑒定細菌是診斷細菌感染的最公認的方法，但傳統的方法缺陷在于培養細菌時間較長、且容易受到接種時間和方法等因素的影響，較難達到對感染早期診斷的目的[3]。所以快速而準確的鑒定鮑曼不動桿菌非常重要。本研究利用表面增強激光解析電離飛行時間質譜技術(surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)快速鑒定鮑曼不動桿菌。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器普通血平板和麥康凱瓊脂平板購自鄭州安圖公司；離心機購自美國BECKMAN COULTER；全自動微生物分析儀VITEK2 Compact購自法國梅里埃公司；蛋白分子量標準品、三氟乙酸(TFA)、芥子酸(SPA)和乙腈(ACN)購自美國Sigma公司；Proteinchip Software、SELDI-TOF-MS分析軟件購自美國Ciphergen Biosystems；PCR擴增儀、電泳儀、凝膠成像儀和Au芯片購自美國Bio-Rad公司；2×Taq PCR masterMix和100 bp DNA Ladder購自北京康為世紀公司；GoldViewTM核酸染料購自北京賽百盛公司；引物由上海英俊公司合成。

1.2研究菌株收集我院2014年1～10月臨床菌株：鮑曼不動桿菌60株、大腸埃希菌30株、肺炎克雷伯桿菌20株、產酸克雷伯菌8株、陰溝腸桿菌19株、奇異變形桿菌7株、枸櫞酸桿菌4株、粘質沙雷菌8株、摩根菌8株、表皮葡萄球菌16株、金黃色葡萄球菌24株、溶血葡萄球菌16株。利用VITEK2 Compact自動微生物分析儀對所有菌株進行鑒定。

1.3方法

1.3.1菌株分組 將所有研究菌株分成訓練組和驗證組。訓練組：鮑曼不動桿菌40株、大腸埃希菌20株、肺炎克雷伯桿菌10株、產酸克雷伯菌8株、陰溝腸桿菌10株、奇異變形桿菌7株、枸櫞酸桿菌4株、粘質沙雷菌8株、摩根菌8株、表皮葡萄球菌10株、金黃色葡萄球菌14株、溶血葡萄球菌10株。驗證組：鮑曼不動桿菌20株、大腸埃希菌10株、肺炎克雷伯桿菌10株、陰溝腸桿菌9株、表皮葡萄球菌6株、金黃色葡萄球菌10株、溶血葡萄球菌6株。

1.3.2細菌培養 由于所有收集菌株保存于-80 ℃冰箱，在研究前將菌株復蘇后接種相應平板，在溫度為35 ℃、CO2濃度為6.5%條件下對菌株培養24 h，然后取單個菌落轉種平板，在相同條件下對菌株再次培養24 h，以便獲得純菌落。

1.3.3多重PCR鑒定鮑曼不動桿菌 利用ITS引物擴增鮑曼不動桿菌的間隔序列，將內參基因recA引物擴增不動桿菌屬的高度保守序列。利用煮沸法提取DNA：挑取血平板上的菌落3～4個，加入300 μl雙蒸水的1.5 ml EP管中，震蕩混勻后在沸水中煮10 min然后以12 000轉/min速度離心5 min，上清液即為模板DNA用于鮑曼不動桿菌基因測定。參照文獻[4]設計多重PCR的引物，recA：F 5'-CCT GAA TCT TCT GGT AAA AC-3'，R 5'-GTT TCT GGG CTG CCA AAC ATT AC-3'，大小約為425bp； ITS：F 5'-CAT TAT CAC GGT AAT TAG TG-3'，R 5'-AGA GCA CTG TGC ACT TAA G-3'，大小約為208 bp。PCR反應體系為25 μl，包括：12 μl 2×Taq Master Mix，9 μl dH2O，ITS正反向引物各1 μl(10 μmol/L)，recA正反向引物各0.5 μl(10 μmol/L)，模板1 μl。PCR反應條件為：94 ℃ 3 min，30循環周期(94 ℃變性30 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延生30 sec)，72 ℃ 3 min。PCR擴增出的產物在瓊脂糖凝膠中電泳后用凝膠成像儀檢測。同時擴增出的recA和ITS片段，確定為鮑曼不動桿菌。只擴增出recA，為其它種的不動桿菌。

1.3.4標本處理 從培養皿上收集純菌落于裝有滅菌水的1.5 mlEP管中，漩渦混勻，經10 000轉/min離心5 min，棄去上清。在上一步的沉淀中加1 ml滅菌水混勻后10 000轉/min離心5 min，棄去上清留下沉淀，充分混勻后備用。

1.3.5校準儀器 使用前需對質譜儀進行校準，標準品為：Insulin(MW5 733.49)、Cytochrome C(MW12 230)、Myoglobin(MW16 950)。

1.3.6上樣 取“1.3.4”部分處理好的細菌懸液4 μl與50%飽和SPA按照1：1比例混勻，將混勻好的標本點在AU芯片上，每個標本重復4次，在室溫條件下干燥5 min。最后在每個樣本孔中加入2 μlSPA(50%飽和)，等其干燥后進行儀器檢測。

1.3.7數據采集和分析 利用蛋白芯片PBSⅡ-C型閱讀機采集檢測數據。設置儀器參數(激光強度190，檢測敏感度為8)，利用Ciphergen proteinchip軟件對檢測結果數據自動收集。鮑曼不動桿菌和對照菌的差異蛋白峰用軟件(BioMarker Wizard和BioMarker Pattern)進行分析，分析數據時參數設置：檢測出有分析價值的蛋白峰出現的頻率閾值(10%)，信噪比(S/N：7)，不同菌株中同一蛋白峰的偏差(<0.3%)，并構建分類樹模型。利用構建的模型對20株鮑曼不動桿菌和51株非鮑曼不動桿菌進行驗證，驗證方法為盲法。

1.3.8AU芯片洗滌及驗證 參照文獻[3]對AU芯片進行洗滌及驗證。

2 結果

2.1多重PCR鑒定鮑曼不動桿菌60株鮑曼不動桿菌在VITEK2 Compact鑒定后利用多重PCR方法能同時擴增出recA基因(425 bp)和ITS片段(208 bp)，以確定60株菌都是鮑曼不動桿菌。

2.2蛋白指紋圖譜結果顯示AU芯片能捕獲近72個細菌蛋白峰，篩選出在兩組之間差異明顯的56個蛋白峰，見圖1。選擇其中M/Z為1 6737.8和5763.61的蛋白峰作為候選蛋白標志物。聚類分析的結果也顯示M/Z為1 6737.8和5763.61的標志物表達差異最明顯。

圖1 鮑曼不動桿菌和對照菌的蛋白質譜圖 橫坐標為M/Z，縱坐標為蛋白表達的豐度。鮑曼不動桿菌 1～3為試驗菌株，其余為對照菌。

2.3建立決策樹診斷模型利用Biomarker Wizard獲得研究數據，然后用BioMarker Pattern對數據進行分析處理，選擇其中的差異蛋白峰構建其分類樹模型。靈敏度在定于0.05的Gini決策分類樹法。擇優選出M/Z為1 6737.8和5763.61兩個蛋白峰來構建鮑曼不動桿菌分類樹模型，見圖2。在第一個蛋白(M/Z：1 6737.8)節點，將149例樣本分為兩組，峰值強度≤4.589的樣本劃分到左邊的終結點1，共105例，鑒定為對照組細菌；峰值強度>4.589的樣本劃分到右邊的結點2，共44例。在第二個蛋白(M/Z：5763.61)節點，將44例結點2中的樣本分為兩組，峰值強度≤0.42的樣本劃分到左邊的終結點2，共5例，鑒定為對照組細菌；峰值強度>0.42的樣本劃分到右邊的終結點3，共39例，鑒定為鮑曼不動桿菌。

圖2 鮑曼不動桿菌分類樹模型

2.4AU芯片清洗及驗證結果AU芯片經過一系列洗滌后檢測發現，在分析臨床菌株蛋白峰的范圍內(相對分子量3000～30000 Da)無殘留物質，提示本研究中洗滌芯片的方案良好，洗凈的AU芯片可以再次使用，見圖3。

圖3 AU芯片洗滌后的檢測結果

3 討論

鮑曼不動桿菌作為條件致病菌，在自然環境中存在非常廣泛。這種細菌有較強的抵抗力，一般的濕熱、化學消毒劑、紫外線對該菌沒有作用，而且該菌特點是定植發生率高、耐藥性也很高[2]。鮑曼不動桿菌是導致院內感染的主要細菌之一，據文獻[1，2]報道鮑曼不動桿菌在灼傷科、神經外科和重癥監護病房(ICU)最為嚴重。鮑曼不動桿菌導致的感染病情嚴重且病死率較高，所以快速準確的鑒定鮑曼不動桿菌顯得尤為重要。

傳統的微生物的鑒定方法主要是基于微生物的形態特征，生理、生化以及分子生物學上，主要有細菌染色、形態、生長特征、動力試驗、代謝產物檢測、生化試驗、血清學、核酸雜交、PCR以及動物實驗等方法來鑒定細菌[3]。但是傳統方法的缺點是耗時長、易受到接種時間及方法的影響，不能滿足臨床上早期的診斷和治療，給患者身體和經濟上帶來極大的負擔。

SELDI-TOF-MS技術是結合了蛋白質芯片和質譜技術的特點。這種方法的特點是：靈敏度高、通量高、可檢出低豐度和低分子量蛋白。不同屬種的細菌蛋白譜不同，相同細菌蛋白譜相似是該技術快速準確鑒定細菌的基礎。早在2009年已有文獻[5，6]報道采用該技術對臨床分離的金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯桿菌可以進行快速而準確的鑒定。有其他文獻[3，7～9]報道該技術能快速準確鑒定臨床分離的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和傷寒沙門氏菌。

為了保證實驗數據的準確性，首先利用多重PCR對全自動微生物分析儀VITEK-2鑒定的60株鮑曼不動桿菌進行分子生物學確認鑒定，可以確定60株菌均為鮑曼不動桿菌。其次采用蛋白分子標準品Insulin(MW5 733.49)、Cytochrome C(MW12 230)和Myoglobin(MW16 950)對質譜儀進行分子量校準，以及對芯片清洗后進行驗證結果處理。本研究利用SELDI-TOF-MS技術對60株鮑曼不動桿菌和160株對照菌進行蛋白峰譜分析，共檢測到72個蛋白峰(相對分子量3000～30000 Da)，其中篩選出有56個表達差異明顯的蛋白峰。將蛋白峰數據導入BioMarker Pattern軟件，擇優選出兩個蛋白峰(M/Z為1 6737.8和5763.61)構建鮑曼不動桿菌分類樹模型。本研究中構建的鑒定模型簡單，分兩層3個葉結點，利用這兩個差異蛋白峰鑒定鮑曼不動桿菌的正確率為97.5%，鑒定本實驗中的對照菌正確率為100%。采用盲法(鮑曼不動桿菌20株、對照菌51株)進行了驗證，其靈敏度和特異性分別為85%、100%。提示該模型的準確性、敏感性、特異性均較高。以上結果提示利用SELDI-TOF-MS可對鮑曼不動桿菌菌株進行快速而準確的鑒定。由于本文未納入更過種屬細菌和其他不動桿菌，故這兩個蛋白峰(M/Z為1 6737.8和5763.61)構建的鮑曼不動桿菌鑒定模型還需要納入更多菌株進行的驗證。

SELDI-TOF-MS是基于核糖體蛋白的差異對細菌進行鑒定，屬于表型分析。所以該技術對一些在進化過程中極其接近，即菌種間核糖體蛋白差異極小的細菌鑒別有一定的難度。且利用SELDI-TOF-MS建立的診斷模型每次只能鑒定一種細菌，故該技術暫時還沒能在臨床上進行廣泛的應用，有待研究者進一步探索。