環境因子對中國海矮擬帽貝種群遺傳多樣性的影響

李媛媛，王珊珊，郭曉雨，崔宇通，王云慧，王儒曉，李釗霞，蔡建平，張運發，曲江勇

(1. 煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005; 2. 煙臺大學數學與信息科學學院，山東煙臺 264005)

生態遺傳研究核心問題是探究生物在其分布邊界的環境中形態、遺傳變異趨勢與規律[1-2]，環境是種群遺傳進化的一個重要因素，物種的分布、行為、生理與遺傳分化受環境因子的影響顯著[3]。生物形體變異是受環境影響最顯著的生理學和生態學特征指標[4]，空間尺度上的種內地理變異反映了物種適應當地環境變異趨向[5]，貝格曼定律假定寒冷地區的同種體型較溫暖地區的更小[6]，此理論同時適用于恒溫動物[7]和外溫動物[8]。研究發現多變量形態度量學方法比傳統的形態學分析方法在反映形態差異方面更有效[9]，目前在海洋生物生態遺傳研究領域上應用廣泛[10]。在形態學差異反映種群間的遺傳差異基礎上，還需結合遺傳變異等共同研討種群遺傳分化等問題，PEPIN[11]認為基于形態特征來進行種群的研究必須通過遺傳學證據予以進一步證明，通過形態標記、遺傳標記來共同闡明種群間的形態與遺傳變異、種群間連續或隔離模式以及受環境、氣候因子影響的種群分化是目前生態遺傳研究的主要方法[11]。生物在適應環境過程中DNA、RNA均會隨生態環境而變化，致使形態、遺傳產生變異[12]。

DNA序列是可以直接從核苷酸序列上分析遺傳變異的遺傳標記，目前已廣泛用于解決動物生態遺傳等問題[13]。動物線粒體DNA (mt DNA)具有分子量小、進化速度快、結構簡單、表現為母系遺傳等特點，其中細胞色素c氧化酶亞基I (COI)基因突變速度較快且進化速率適中，可用于種群水平的遺傳多樣性分析[14]。

矮擬帽貝(Patelloidapygmaea)屬于軟體動物門(Mollusca)笠貝科(Acmaeidae)[15]，中國海沿岸習見種。該種普遍分布于海岸帶以上到淺層潮下帶的整個潮間帶，營附著生活，適宜生存的環境因子跨度大，受古地理歷史事件及現今環境、氣候因子影響明顯，是研究種群生態遺傳的模式物種[16-18]。目前矮擬帽貝研究主要集中在系統學和分類學等領域[19]，對現今環境因子影響的遺傳進化和形態變異并未得到進一步的研究[20]。本研究選取矮擬帽貝線粒體基因COI序列作為分子標記，探究環境因子對矮擬帽貝遺傳多樣性的影響，以期對中國海矮擬帽貝種群遺傳多樣性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣及測序

矮擬帽貝采集于中國海13個地域137個個體(圖1)，于無水乙醇中保存；并測量其形態量度[殼長(length,L)、殼寬(width,W)、殼高(height,H)、殼周長(perimeter,P)、短斜邊(short hypotenuse,SH)、長斜邊(long hypotenuse,LH)、干重(dry weight,DW)、壁厚(wall thickness,WT)]并計算頭端角度(headend angle,HA)與尾端角度(end angle,EA)(表1，部分形態數據參考之前已發表論文[21])。

總DNA提取采用DNeasy?組織&血液試劑盒(GTIN：04053228006077，Lot：151046088，GIAGEN，德國)。使用COI通用引物進行PCR擴增(華大基因合成)，COIForward：5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3;COIReverse：5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3[22]，25 μL的PCR擴增反應體系。PCR反應條件設置：94°C預變性2 min；94°C變性30 s，42°C退火40 s，72°C延伸50 s，35個循環；72°C延伸5 min。反應結束后利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR產物進行ABI PRIMS 3730雙向測序。

1.2 環境因子

獲取采樣地近30年氣象數據[年平均氣壓(annual average pressure,AAP)、年平均氣溫(annual average temperature,AAT)、年平均降水量(annual average precipitation,AAPR)、日照百分率(sunshine percentage,SP)、日照時數(sunshine hours,SS)、年平均水汽壓(annual average vapor pressure,AAVR)]并計算各因子變異系數[年平均氣壓變異系數(annual average pressure variation coefficient,VAAP)、年平均氣溫變異系數(annual average temperature variation coefficient,VAAT)、年平均降水量變異系數(annual average precipitation variation coefficient,VAAPR)、日照百分率變異系數(sunshine percentage variation coefficient,VCSP)、日照時數變異系數(sunshine hours variation coefficient,VCSS)、年平均水汽壓變異系數(annual average vapor pressure variation coefficient,VAAVR)]，數據來源中國氣象數據共享服務網(http://data.cma.cn/)并參考已發表論文[21]及各地的經度(longitude,LO)和維度(latitude,LA)。

1.3 統計分析

為排除個體生長周期等因素對研究結果的影響，以樣本干重為基數換算各形態量度相對值，并統計計算平均數與標準差，通過SPSS 20.0[23]計算如下數據，單因素方差分析(ANOVA)測平均數差別的顯著性檢驗、正態分布檢驗(Kolmogorov-Smirnov test)判斷數據是否符合正態分布、形態變異主成分分析提取主成分及與環境因子相關性分析衡量兩個變量因素的相關密切程度。

1.4 序列分析

得到的測序結果利用Conting軟件進行拼接；CLUSTAL_X 1.83進行序列比對；DnaSP v5[24]獲得單倍型信息；ARLEQUIN 3.5[25]軟件計算群體遺傳多樣性指數；MEGA7計算序列變異(S)[26]。

2 結果與分析

2.1 形態變異分析

中國海13個地域137個個體的相對形態量度ANOVA分析結果顯示各形態量度差異均為顯著。主成分分析提取L/DW(92.21%)、W/DW(5.72%)、H/DW(1.60%)為形態變異主成分(表2)，將其與樣本量進行Pearson檢驗，提取的主成分均不受樣本量影響，因此形態變異主成分可作為該物種形態變異的指標。

2.2 序列變異與遺傳多樣性

137個矮擬帽貝個體線粒體DNACOI部分序列(601bp)堿基含量：A： 24.10%、T： 37.27%、C： 16.53%、G： 22.10%，共發現217個多態位點，轉換顛換比為1.25，無插入/缺失，界定30個單倍型，占樣本總數的21.89%。AMOVA結果顯示，矮擬帽貝遺傳變異主要來源于種群間(89.57%，P<0.001)。各種群遺傳多樣性比較顯示，汕頭(ST)種群呈現較高的遺傳多樣性，威海(WH)種群呈現較低的遺傳多樣性(表3)。對COI分子標記的遺傳多樣性指數進行圖示法和正態分布檢驗，所有遺傳多樣性指數都服從正態分布。與樣本量之間的相關性分析結果顯示，各多樣性指數均不受個體數量的影響(P>0.05)，正態分布檢驗和相關性分析的結果說明此數據可以用于表示各地理種群的遺傳多樣性高低。

2.3 遺傳多樣性和形態量度與環境因子的相關性分析

統計13個采樣地的環境因子(表4)并進行正態分布檢驗，結果表明所有數據均為正態分布，具有統計學意義。遺傳多樣性與環境因子相關性分析結果表明(表5)，矮擬帽貝種群單倍型多樣性、核苷酸多樣性以及序列變異與緯度、年平均氣溫變異系數、年平均降水量變異系數、日照百分率及日照時數呈顯著負相關(P<0.05)，

與年均氣溫、年均降水量及年均水汽壓呈顯著正相關(P<0.05)。

圖1 矮擬帽貝采樣圖Fig.1 Sampling map of P. pygmaea注：“()”內為采樣數量；JZ：錦州；ZH：莊河；DL：大連；YT：煙臺；WH：威海；QD：青島；LYG：連云港；ZS：舟山；XM：廈門；ST：汕頭；MM：茂名；ZJ：湛江；BH：北海Note: Value in “()” is sampling number； JZ: Jinzhou; ZH: Zhuanghe; DL: Dalian; YT: Yantai; WH: Weihai; QD: Qingdao; LYG: Lianyungang; ZS: Zhoushan; XM: Xiamen; ST: Shantou; MM: Maoming; ZJ: Zhanjiang; BH: Beihai

表1 矮擬帽貝形態數據的平均數(標準差)Tab.1 Mean values (standard deviation) of the morphological data of P. pygmaea populations

注：JZ：錦州；ZH：莊河；DL：大連；YT：煙臺；WH：威海；QD：青島；LYG：連云港；ZS：舟山；XM：廈門；ST：汕頭；MM：茂名；ZJ：湛江；BH：北海

Note: JZ: Jinzhou; ZH: Zhuanghe; DL: Dalian; YT: Yantai; WH: Weihai; QD: Qingdao; LYG: Lianyungang; ZS: Zhoushan; XM: Xiamen; ST: Shantou; MM: Maoming; ZJ: Zhanjiang; BH: Beihai

表2 矮擬帽貝形態變異的主成分分析Tab.2 Principal component analysis of P. pygmaea morphological variations

注：JZ：錦州；ZH：莊河；DL：大連；YT：煙臺；WH：威海；QD：青島；LYG：連云港；ZS：舟山；XM：廈門；ST：汕頭；MM：茂名；ZJ：湛江；BH：北海

Note: JZ: Jinzhou; ZH: Zhuanghe; DL: Dalian; YT: Yantai; WH: Weihai; QD: Qingdao; LYG: Lianyungang; ZS: Zhoushan; XM: Xiamen; ST: Shantou; MM: Maoming; ZJ: Zhanjiang; BH: Beihai

表3 矮擬帽貝的遺傳多樣性(標準差)Tab.3 Genetic diversity of P. pygmaea(standard deviation)

注：JZ：錦州；ZH：莊河；DL：大連；YT：煙臺；WH：威海；QD：青島；LYG：連云港；ZS：舟山；XM：廈門；ST：汕頭；MM：茂名；ZJ：湛江；BH：北海

Note: JZ: Jinzhou; ZH: Zhuanghe; DL: Dalian; YT: Yantai; WH: Weihai; QD: Qingdao; LYG: Lianyungang; ZS: Zhoushan; XM: Xiamen; ST: Shantou; MM: Maoming; ZJ: Zhanjiang; BH: Beihai

表4 13個矮擬帽貝地理種群近30年環境因子的平均值(標準差)Tab.4 Average values of environmental factors of 13 P. pygmaea populations in 30 years(standard deviation)

注：JZ：錦州；ZH：莊河；DL：大連；YT：煙臺；WH：威海；QD：青島；LYG：連云港；ZS：舟山；XM：廈門；ST：汕頭；MM：茂名；ZJ：湛江；BH：北海

Note: JZ: Jinzhou; ZH: Zhuanghe; DL: Dalian; YT: Yantai; WH: Weihai; QD: Qingdao; LYG: Lianyungang; ZS: Zhoushan; XM: Xiamen; ST: Shantou; MM: Maoming; ZJ: Zhanjiang; BH: Beihai

表5 矮擬帽貝遺傳多樣性和形態量度與環境因子的相關性分析Tab.5 Relationship correlation between genetic diversity and morphology of P. pygmaea and environmental factors

注：*:P<0.05;**:P<0.01.

Note:*:P<0.05;**:P<0.01.

形態變異與環境因子相關性分析結果表明，主成分L/DW、W/DW、H/DW與年均降水量呈顯著負相關(P<0.05)。

3 討論

中國海矮擬帽貝各地理種群的COI序列研究表明，矮擬帽貝的單倍型多樣性(0.200～0.867)較高且核苷酸多樣性(0.000 7～0.091 4)較低，這一結果與GRANT等[27]提出的海洋類生物結果相符，說明該類型種群可能經歷過歷史擴張事件。

遺傳結構分化和自然環境變遷之間的相互作用導致生活在不同環境下的矮擬帽貝存在地理變異[28-29]。環境因子對生物進化的影響顯著，溫度和降水量則是影響物種進化的兩個最重要的環境因子[30]。

溫度是貝類存活、生長、免疫、代謝的關鍵環境因子[31]，研究發現太平洋牡蠣(Crassostreaglgas)、華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)、蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)、馬氏珠母貝幼蟲(Pinctadamartensii)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)等遺傳變異、分化均受氣候變暖影響顯著[32-33]；海洋其它類生物研究發現，高溫脅迫下紫色球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)蛋白代謝基因和信號傳導基因的改變致使產生遺傳分化[34]，原綠球藻(Prochlorococcus)因生存溫度不同，垂直分布的不同種群間遺傳結構存在差異且溫度越高遺傳多樣性越高[35]。矮擬帽貝遺傳多樣性與環境因子相關性分析表明，年均氣溫越高，種群遺傳多樣性越高，且隨緯度的降低而升高。由此推測矮擬帽貝主要以巖石海床為棲息地，溫度是影響物種代謝及性成熟的直接因素，繼而影響種群遺傳多樣性，簡而言之，溫度越穩定遺傳多樣性越高，這與其它軟體動物生態研究結果基本一致[36]。

矮擬帽貝遺傳多樣性與年均降水量、年均水汽壓呈顯著正相關，與日照百分率、日照時數呈顯著負相關。降水量是影響生物遺傳變異的另一重要因子[37]，降水量直接反應空氣環境中水分含量，水汽壓間接代表大氣中水汽含量，大氣中水汽含量多時，水汽壓越大[38]；且日照越強，大氣水汽含量越低，說明空氣中水汽含量可能是影響矮擬帽貝遺傳多樣性的重要因素。矮擬帽貝作為潮間帶生物，其生境可能更適于空氣水分含量高的環境；且日照時數越短，遺傳多樣性越高，說明較退潮時裸露的日照環境，矮擬帽貝更趨向于海面下生存。另一種解釋則為降水直接影響到矮擬帽貝生活區域的海水鹽度，產生外界壓力導致物種基因進化速率產生分歧。海水鹽度是影響海洋生物生存生長至關重要的環境因子，受緯度(正相關)、降水量(負相關)、水氣壓(負相關)等多種因素的調節[39]。貝類生物對環境壓力和環境鹽度變化的適應性較差，環境因子可影響其生長發育進而導致遺傳分化。SORIA等[40]的研究顯示，隨著鹽度逐漸升高，智利扇貝(Argopectenpurpuratus)稚貝的氧循環和氮循環基因隨之發生改變，導致遺傳分化。由此得出鹽度可以影響貝類能量和滲透壓的變化。研究表明，在鹽脅迫下貝類需要依靠能量代謝來維持體內滲透壓的平衡，但是，鹽度超出自身滲透壓調節的范圍，貝類的死亡率會升高[41]。外界非生物環境因素傾向于比內源的因素(如機體發育)變化更快，研究表明外源環境因素比內源機體因素更能促進遺傳表達分化[42]。矮擬帽貝遺傳多樣性隨緯度的降低而升高，與上述海水鹽度(緯度與海水鹽度呈正相關)降低導致遺傳多樣性升高結果一致，且從地理位置來看南部種群具有比北部種群有更深的遺傳譜系、更高的遺傳多樣性。

海洋生物地理種群間的形態變異受到遺傳因子和棲息地氣候因子的雙重影響[43]，且形態量度主成分與年均降水量變異系數呈顯著負相關，說明降水量是影響形態變異的主要因素，作為潮間帶物種，落潮期暴露在空氣中，受雨水的沖刷腐蝕導致形態產生差異，同時降水對生活區的水體鹽濃度影響會導致攝食的變化而使形態產生差異。相對形態量度和其它環境因子的相關性分析表明其趨勢與遺傳分析的結果基本一致[44]，與個別環境因子相關性趨勢存在差異，其主要原因是自然選擇導致物種基因遺傳與形態變異的模式不同[45]。在穩定的環境中，自然選擇壓力的降低可以最大限度地保留基因型，遺傳多樣性升高；在不穩定的環境中，保留的種群適應多變環境，在選擇壓力下其有利的基因型被保留，遺傳多樣性則降低。