基于線粒體D-loop序列的長江口中華鱘幼魚遺傳多樣性分析

孫麗婷,趙 峰,張 濤,紀 嚴,莊 平

(1中國水產科學研究院東海水產研究所，中國水產科學研究院長江口漁業生態重點實驗室，上海 200090；2上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306)

中華鱘(Acipensersinensis)屬鱘形目(Acipenseriformes)，鱘科(Acipenseridae)，鱘屬，為我國一級水生野生保護動物，是一種典型的江海洄游型魚類，生活史極其復雜。每年6—8月，性腺發育至Ⅲ期的成體由東海經長江口，洄游進入長江，于翌年的10—11月在上游產卵場進行繁殖，產后親魚即返回海洋[1]。仔魚孵化后順流而下，在翌年4月末至5月初時到達長江口，經過4～5個月的索餌肥育于8月末至9月初洄游進入海洋生活[2]。20世紀中后期以來，由于大型水利工程修建、水體污染和過度捕撈等因素的影響，中華鱘野生種群呈衰退趨勢，洄游至葛洲壩下產卵場的繁殖群體呈現出數量下降、雌雄性比失衡、繁殖頻次下降、繁殖規模減小和產卵活動延遲等現象[3-7]。近年來，中華鱘野生種群衰退的趨勢進一步加劇。2010年，世界自然保護聯盟(IUCN)將中華鱘列入瀕危物種紅色名錄極危(CR)物種行列。2013年以來，每年到達葛洲壩下產卵場的繁殖群體已不足50尾[8]。更為嚴重的是，2013年、2015年和2017年的繁殖季節，均未監測到自然繁殖活動，僅2014年和2016年發生自然繁殖，野生種群出現了偶發產卵現象[7]。

遺傳多樣性是保護生物學研究的核心之一，及時了解和掌握物種種內遺傳變異的大小、時空分布及其與環境的關系，有助于采取科學有效的措施對瀕臨滅絕的物種加以保護和拯救。已有研究表明，無論是在蛋白質水平還是核DNA水平，中華鱘野生群體的遺傳多樣性比洄游魚類的平均水平偏低[9-11]；葛洲壩截流以后，中華鱘野生幼魚群體的遺傳多樣性又進一步降低[12]。近幾年微衛星標記數據顯示，中華鱘野生幼魚群體的遺傳結構趨于穩定[13]。本研究利用線粒體控制區(mitochondrial control region, D-loop)序列分析技術，研究了2015年和2017年長江口野生中華鱘幼魚的遺傳多樣性，旨在及時了解和掌握長江口中華鱘野生幼魚的遺傳多樣性狀況并推算參與自然繁殖的雌性親本數量，為相關物種保護和管理提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

利用2015年和2017年春夏季在上海崇明長江口東灘及其臨近水域監測及漁民誤捕的野生中華鱘幼魚為實驗樣本(表1)。誤捕死亡的個體取背部肌肉，存活的個體取鰭條，分別保存于無水乙醇備用。

表1 野生中華鱘幼魚樣本Tab.1 Samples of wild juvenile Acipenser sinensis

1.2 基因組DNA的提取

取肌肉(鰭條)約100 mg，使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(北京，天根生化科技有限公司)提取總DNA，-20 ℃保存。

1.3 線粒體D-loop序列的PCR擴增、純化與測序

使用引物DL: 5′CAAGAACACAAGATTAAT GAG3′ ; H740: 5′ GATCAAGGTATGTCGATGACA 3′[14]，擴增中華鱘的mtDNA 的D-loop部分序列。PCR 總反應體系為25 μL，其中包括：10×PCR buffer 5 μL, dNTP 4 μL (2.5 mmol·L-1)，上下游引物各1 μL (10 mmol·L-1),TaqDNA 聚合酶0.8 μL (5 U·μL-1)，模板DNA 1μL, 加雙蒸水至總體積 25 μL。樣品在AG-22331 型PCR 儀(Eppendorf) 上進行擴增, 94 ℃ 預變性 5 min; 94 ℃ 30s, 51 ℃ 45s, 72℃ 1min, 35個循環; 72 ℃ 延伸10 min; 4 ℃ 保存。擴增產物使用1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海杰李生物技術有限公司進行膠回收雙向測序。測序結果采用BLAST在NCBI數據庫中進行比對分析。

1.4 數據分析

利用Clustal X[15]對序列進行對位排列并結合人工核查與校正。利用DnaSP5.0軟件[16]確定單倍型數目及分布、核苷酸多樣性等。MEGA5.1[17]計算其堿基含量、變異位點數、簡約信息位點數、群體內及群體間的遺傳距離。使用MEGA5.1軟件[17]中的鄰接法(neighbor-joining，NJ)構建單倍型之間的系統發生聚類樹，單倍型聚類樹中節點處的置信度用Bootstrap 1000次重復檢驗。利用Arlequin3.1[18]進行分子變異方差分析(AMOVA)評估群體間的遺傳變異。使用分化指數(Fst)[19]評價群體間的遺傳差異，使用1000次重復抽樣檢驗群體間Fst的顯著性。群體間的基因流通過公式Nm= (1-Fst)/(4Fst)計算。

2 結果與分析

2.1 序列變異特征

2個年度830個野生中華鱘幼魚的線粒體D-loop區可比序列長度為462 bp，變異位點26個(包括插入和缺失位點)，變異比率5.63%，其中簡約信息位點8個，單變異位點18個，變異多為轉換和顛換，有1個插入缺失位點(圖1)。4種堿基C、T、A和G的平均含量分別為17.54%、32.22%、26.83%和23.41%。中華鱘幼魚線粒體D-loop的堿基組成具有較大的偏向性，C的含量顯著低于其它3種堿基的含量，A + T(59.05%)含量顯著高于G + C(40.95%)。

圖1 中華鱘線粒體控制區序列的變異位點Fig.1 Variable nucleotide sites of mtDNA D-loop of Acipenser sinensis

2.2 單倍型分布及遺傳關系

在2015年的672個樣本中檢測到11個單倍型，2017年158個樣本中檢測到8個單倍型，2個年度個體的單倍型分布如圖2所示。2個年度間共享單倍型有3個，占單倍型總數的18.75%； 2015年個體擁有8個特有單倍型，其中Hap5的出現頻次最高，共221個，占32.89%，Hap8和Hap11均只有1個個體。2017年個體擁有5個特有單倍型，其中Hap12出現的頻次最高，共31個，占19.62%。

2.3 中華鱘的遺傳多樣性和遺傳結構

中華鱘2個年份樣本間的遺傳多樣性參數見表2。2015年樣本共11個單倍型，單倍型多樣性(h)0.799±0.008，核苷酸多樣性(π)0.009 3±0.005 1，平均核苷酸差異數4.005；2017年樣本共8個單倍型，單倍型多樣性(h)0.848±0.008，核苷酸多樣性(π)0.012 3±0.006 6，平均核苷酸差異數5.081，2017年幼魚的遺傳多樣性略高于2015年。

從遺傳距離來看，2015年與2017年幼魚樣本間的遺傳距離為0.0102，沒有明顯的分化現象；各單倍型之間的平均遺傳距離為0.0124。兩個年度樣本間的Fst值為0.0830 4(表3)，基于Fst計算年度樣本間的基因流Nm為2.76。AMOVA分子變異方差分析表明，長江口野生中華鱘幼魚兩個年度群體間的變異為8.30%，群體內變異為91.70%，群體內變異大于群體間變異。

圖2 中華鱘16個單倍型的分子系統樹及其分布Fig.2 Distribution of 16 haplotypes between 2 populations of Acipenser sinensisand its NJ molecular phylogenetic tree注：節點數字表示>50%的Bootstrap 支持率；括號內為樣本數(2015/2017)Note: Numbers at nodes indicate bootstrap values greater than 50% with 1000 replicates， and the sample sizes are given in parentheses (2015/2017)

表2 野生中華鱘幼魚的遺傳多樣性參數Tab.2 Parameters of genetic diversity of wild juvenile Acipenser sinensis

表3 中華鱘群體的AMOVA分析結果Tab.3 Results of AMOVA for Acipenser sinensis populations

注：Va、Vb分別表示群體間變異和群體內變異

Note:Va,Vbmean variations among populations and within populations

3 討論

3.1 中華鱘的繁殖群體規模

mtDNA遵循嚴格的母系遺傳，一般不發生重組，后代能夠完整的保存母本遺傳信息，mtDNA一個單倍型即可代表一個母系集團，較少的樣本就能反應群體的遺傳結構[20]。根據2015年和2017年長江口中華鱘幼魚線粒體DNA的D-loop區序列單倍型數量，我們推測2014年參與自然繁殖的雌性親魚數量至少有11尾，2016年至少有8尾。廖小林等[21]對2016年采集的95顆中華鱘受精卵測序分析顯示，壩下產卵場至少有10尾雌魚參與了自然繁殖，本研究結果與之相差不大。

調查顯示，2014年長江葛洲壩下游宜昌江段的中華鱘繁殖群體數量為57尾，2016年繁殖季節產卵場水聲學探測數量為48尾[8]。根據歷史數據葛洲壩下中華鱘繁殖群體的雌雄性比為5.86∶1[3]，推算出2014年的57尾親魚中約有49尾雌魚，8尾雄魚；2016年的48尾親魚中約有41尾雌魚，7尾雄魚。葛洲壩截流后，到達壩下產卵場的親魚出現了不同程度的性腺退化現象[22-23]，繁殖群體的性腺成熟比例從截流前的35%～50%[24]下降到10%～30%[25]，據此計算得到2014年參與自然繁殖的雌性親鱘在5～15尾，2016年4～12尾，本研究與計算結果較為吻合。

根據長江口幼魚監測數據，2015年幼魚到達長江口的規模大，數量多達上千尾[8]，而2017年春夏到達長江口的中華鱘幼魚規模較小。根據本研究的結果，2017年參與自然繁殖的雌性親本數量略小于2015年，與監測數據相符。葛洲壩截流初期壩下產卵場調查顯示，在1983—1985年，年均有26尾親鱘參加產卵，性比穩定在1∶1左右，1986年后每年有30～40尾親魚在壩下產卵[26]。當前壩下產卵場參與產卵的雌性親魚在10尾左右，性比失衡，中華鱘自然繁殖群體規模下降趨勢明顯；2005—2013年間，長江口中華鱘幼魚的補充量波動劇烈，總體呈下降趨勢[27]；近兩年發生偶發產卵現象后，長江口中華鱘幼魚資源豐欠差異明顯，中華鱘的群體補充岌岌可危。

3.2 中華鱘群體的遺傳多樣性

從線粒體D-loop區序列分析來看，2015年和2017年長江口中華鱘幼魚的平均單倍型多樣性為0.857 ± 0.006，平均核苷酸多樣性為0.010 2± 0.005 5。其中，2017年野生幼魚的遺傳多樣性略高于2015年的野生幼魚群體。已有研究表明，1995—2000年間長江中野生中華鱘繁殖群體(該樣本能代表葛洲壩截流前的中華鱘野生群體)的線粒體D-loop區平均單倍型多樣性為0.949±0.010，平均核苷酸多樣性為0.011±0.006[28]。與之相比，當前野生中華鱘群體的遺傳多樣性低于截流前，但仍然具有較高的遺傳多樣性水平。中華鱘個體生活周期長達十幾年，甚至幾十年，生活史極其復雜。在其生活史中，個體初次性成熟的時間不同，同一世代的不同個體進行生殖洄游的時間不一致，同年到達產卵場的繁殖群體的年齡和世代結構比較復雜[3]；在進行首次繁殖后有數年的繁殖間期[29]，相鄰2～3年間群體的相似性很小，這樣會極大地降低近交衰退的幾率，這對中華鱘有效維持種群遺傳多樣性起到重要作用。由于親本數量極少，不同年度間繁殖群體的差異，可能也是造成2015年與2017年幼魚樣本遺傳多樣性差異的原因。

從單倍型分析來看，2個年份的中華鱘幼魚群體具有共享單倍型，說明其可能在歷史上具有共同的母本。AMOVA分析顯示，年度樣本間的變異為8.30%，群體內的變異為91.70%，群體內變異大于群體間的變異，單倍型之間的平均遺傳距離(0.012 4)略高于年度樣本之間的遺傳距離(0.010 2)。以上結果均表明，中華鱘作為一個單一種群，其遺傳變異主要來源于群體內。在張四明等[29]的研究中，截流前的野生中華鱘群體年度樣本之間沒有明顯的分化現象；趙娜等[11]通過對等位基因的分布進行聚類運算也得到，中華鱘群體的年度樣本之間差異小，遺傳差異主要存在群體內。這種遺傳結構能夠使中華鱘種群的遺傳多樣性水平得以維持，不致因某一世代繁殖受阻或數量減少而驟降，有助于維持種群的遺傳多樣性。本研究中，2015年與2017年群體之間Fst為0.083 04 (0.05

盡管目前野生中華鱘種群仍然維持著相對較高的遺傳多樣性，但從已有研究可以看出，相比長江葛洲壩截流前，2000年時長江口中華鱘幼魚遺傳多樣性水平已然在下降[12]，2015年的微衛星標記研究結果也證實了野生中華鱘幼魚的遺傳多樣性水平逐漸降低的趨勢[31]。當前日漸衰竭的種群資源量，勢必會導致群體中發生遺傳漂變和遺傳多樣性的逐漸喪失，中華鱘面臨滅絕的危險，恢復野生中華鱘種群資源迫在眉睫。通過分子生物學手段了解中華鱘現有種群遺傳結構，以確定保護單元，建立人工種群并對其進行遷地保護。在當前的全人工繁殖技術和保護遺傳學的基礎上，可在不同的養殖環境中建立不同的人工種群，互相補充，保證人工種群的遺傳多樣性，以保存中華鱘的種質資源。

致謝：中國水產科學研究院東海水產研究所馬春艷副研究員、汕頭大學馬洪雨教授在實驗過程中給予很大的幫助，一并表示感謝!