苯磺隆對甘藍型油菜的殺雄效果及對其靶標ALS活性的影響

付三雄,周曉嬰,戚存扣

(江蘇省農業科學院/農業部 棉花油菜重點實驗室,江蘇 南京 210014)

目前我國油菜育種的主攻目標為選育優質雜交種,即把優質育種和雜種優勢育種結合起來。實踐表明,油菜具有明顯的雜種優勢。目前,利用油菜雜種優勢的主要途徑有細胞質雄性不育(CMS)、細胞核雄性不育(NMS)、自交不親和(SI)及化學雜交劑(CHA, chemical hybridizing agent)等[1]。利用化學雜交劑生產雜交種具有許多優點,例如：(1)親本選擇范圍廣。化學殺雄雜種油菜是通過CHA誘導的生理性雄性不育系,不存在像細胞核質互作雄性不育體系中所要求的恢保關系,因此親本選擇自由,可任意組配雜交組合,有利于優中選優,篩選出較強的優勢組合；(2)選育周期短。利用CHA可允許直接使用那些已改良產量、抗病性和品性的育種品種作雜交親本,不需要較長的時間來進行三系的研制、轉育、測試和培育,可在短時間內生產出足夠數量的F1代種子；(3)避免了不育系微粉問題；(4)可利用F2代的優勢。化學殺雄雜交種不存在育性恢復問題,雜交的后代又無育性分離,有實現雜種優勢多代利用的可能性；(5)可有效代替人工去雄,大大減輕育種工作量[2]。因此,化學雜交劑育種將成為油菜雜種優勢利用的一條重要途徑。

研究和實踐表明,苯磺隆是可用于油菜育種的高效無毒的化學殺雄藥物[3-4]。磺酰脲類超高效除草劑的作用靶標是乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase, ALS)[5]。由于在人或動物體內并未發現ALS,因此這種除草劑對人和動物十分安全。乙酰乳酸合成酶(ALS, EC4.1.3.18或acetohydroxy acid synthase, AHAS),是植物和微生物體內合成支鏈氨基酸(branched-chain amino acid, BCAA,亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)途徑的首要限速酶[6-7],是由核基因編碼、定位于高等植物葉綠體中的一種蛋白。由于它是多種除草劑和生長抑制物質的作用靶標,只存在于植物和微生物中,因此ALS抑制型農藥對人畜比較安全。近幾十年來,國內外學者對油菜化學雜交劑育種進行了廣泛的研究。湖南農業大學、西南大學、四川大學、陜西省雜交油菜研究中心等單位利用化學雜交劑制種技術已經育成推廣了“湘雜油”、“渝黃”、“秦優”、“寧雜”等系列的20多個油菜雜交種,產生了明顯的社會、經濟效益[8～11]。油菜化學殺雄劑研究尤其是其使用雖然取得了長足的進步,但其相關基礎研究仍然很薄弱,目前的研究主要集中在殺雄劑的研制及培育品種方面,而在應用基礎方面的研究較少；油菜化學殺雄劑施用后對其靶標酶ALS活性的影響僅有零星研究[12],還需要進一步研究。本研究選用兩個化學殺雄國審品種的母本,綜合前人的研究結果,使用0.2 μg/mL苯磺隆殺雄劑在油菜小孢子發育單核期進行葉面噴施,分析了苯磺隆對油菜花器形態、農藝性狀、油菜相對結實率的影響以及對ALS活性的影響,以期為在早期快速鑒定噴藥效果及深入研究甘藍型油菜化學殺雄的分子機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘藍型油菜品種(系)寧油18號(化學殺雄國審品種寧雜1818的母本)和096030(化學殺雄國審品種寧雜1838的母本)來自江蘇省農業科學院經濟作物研究所,經多代自交純合。供試藥物苯磺隆為江蘇省激素研究所股份有限公司生產的10%苯磺隆可濕性粉劑。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗 試驗于2016～2017年在江蘇省農業科學院溧水植物科學基地進行。在2016年10月8日播種,試驗設置3個生物學重復,4行區,行長3.3 m,行距0.4 m,每行定苗20棵。田間管理同一般大田。

1.2.2 苯磺隆處理 葉面噴施苯磺隆濃度為0.2 μg/mL(有效成分的濃度)。噴藥時期試驗以70%油菜植株主花序最大花蕾長度為標志,噴施處理于油菜最大花蕾長度為1～2 mm時進行,用小型手動噴霧器均勻噴施藥物于葉面,用塑料布把兩邊相鄰的小區遮蓋。葉面噴施第一次處理于2017年2月26日中午進行,單株用藥量為8～10 mL；第二次處理相隔10 d(2017年3月9日)進行,單株用藥量為8～10 mL。對照采用相同用量的水噴施。

1.2.3 觀察和統計方法 在油菜初花期,噴施苯磺隆處理的3個重復從第2行的第2株開始連續選取10株掛牌,整株套袋自交用于后續考種；對照采用相同方法每重復選取10株掛牌，用于后續考種。在油菜盛花期,于上午10:00在每重復選取的10株主花序最上部摘取3朵當天開放的花朵,統計雌蕊長度、雄蕊長度、花瓣長、寬。在收獲前考察每重復選取的10株的株高、一次分枝數、主花序長、角果數、每角粒數、角果長度，計算相對結實率(處理的單株總粒數/對照的單株總粒數)。

1.2.4 ALS活性的測定 于第一次苯磺隆處理后3 d，取油菜2 mm左右的花蕾于液氮中速凍,保存于-80 ℃的冰箱中，用于ALS活性的測定。參照Singh等[13]的方法測定ALS活性。以丙酮酸鈉為底物,在波長530 nm處測定酶促反應產物乙酰乳酸轉化產物3-羥基-2-丁酮(acetoin)的量,計算ALS活性。以單位時間(h)內單位質量蛋白(mg)生成產物3-羥基-2-丁酮的含量定義為酶活力,單位為μmol/(mg·h)。

1.2.5 數據處理 利用Excel和SPSS統計軟件進行數據整理與統計分析。

2 結果與分析

2.1 苯磺隆處理誘導油菜雄性不育的效果

與對照相比,經0.2 μg/mL苯磺隆處理后，油菜花瓣變小,雌蕊長度與對照無明顯差異,雄蕊長度顯著短于對照的,且花藥干癟(圖1、表1)。

葉面噴施0.2 μg/mL的苯磺隆對寧油18號和096030油菜主要農藝性狀的影響見表2。從表2可以看出：0.2 μg/mL苯磺隆處理對油菜株高、角果長度、每角粒數有顯著的抑制作用,但對一次分枝數無顯著影響，對主花序長有一定的促進作用。用0.2 μg/mL的苯磺隆進行葉面噴施處理后寧油18號和096030的相對結實率分別僅有3.97%和4.03%。綜上所述,葉面噴施0.2 μg/mL苯磺隆可誘導油菜雄性不育，處理2次可誘導100%的全不育株率,使整個花期不育,相對結實率僅約4%。因此,葉面噴施0.2 μg/mL苯磺隆2次可以滿足油菜大田制種純度的需要。

注:“**”表示與對照在0.01水平上差異顯著。下同。

2.2 苯磺隆處理下油菜ALS活性的變化

從表3可以看出,經0.2 μg/mL苯磺隆處理后,2種油菜中的ALS活性均較對照顯著降低，其中寧油18號和096030經處理后的ALS相對酶活分別為40.63%和37.23%。

3 討論與結論

合適的苯磺隆濃度是影響油菜化學殺雄效果的重要因素,濃度小,殺雄不徹底;濃度過大,易出現藥害,影響結實率,導致制種產量低。雖然濃度與劑量也可以高低搭配使用,但與劑量相比,濃度是更重要的因素,如果濃度較低,劑量較大,不能達到理想的殺雄效果;反之,在一定劑量下,高濃度比低濃度殺雄效果好,導致藥害的可能性也加大。前人研究發現磺酰脲類用于殺雄的最低濃度為0.02 μg/mL,最高濃度為20 μg/mL。張寶娟等[3]的研究結果表明,苯磺隆葉面噴施處理濃度范圍為0.075～0.1 μg/mL,單株用藥量為15～20 mL時,殺雄徹底,藥害較輕。黃馳等[4]的研究結果表明：在成都地區油菜重要骨干自交系主花序最大花蕾長度達1.50～2.00 mm時用苯磺隆進行第一次葉面噴施,隔10 d左右再進行第二次噴施,每次單株受藥量8～10 mL,0.30 μg/mL苯磺隆可誘導群體90%以上的不育株率;每次單株受藥量15～20 mL,0.05～0.10 μg/mL苯磺隆可誘導群體100%的不育株率,且無藥害,能保持整個花期不育。綜合前人的研究結果,我們通過葉面噴施0.2 μg/mL苯磺隆,單株用藥量8～10 mL,間隔10 d左右再進行第2次處理,單株用藥量8～10 mL,葉面噴施2次可誘導100%的全不育株率,使整個花期不育,相對結實率僅約4%,表明0.2 μg/mL苯磺隆處理2次可以滿足油菜大田制種純度的需要。

表2 葉面噴施苯磺隆對油菜主要農藝性狀的影響

表3 葉面噴施苯磺隆對油菜中ALS活性的影響

阻礙油菜化學殺雄劑推廣應用的一個難點是化學殺雄劑使用后的效果評價。以往研究僅僅側重于從花瓣的大小及直徑、柱頭長短、結實率、植株育性及植株高度等性狀評價化學殺雄劑的效果,但是要獲取這些評價指標基本在藥效發揮的中后期及結實期,對于化學殺雄劑噴藥量及噴藥效果的預測無能為力,若發生藥害或噴藥量不足,想再實施補救措施則為時已晚。因此如何在早期快速鑒定噴藥效果成了當前亟待解決的問題。近年來有不少通過測定ALS的活性來研究植株對除草劑抗性的快速鑒定方法[14-15]；李亞東等[16]的研究結果表明,新疆不同小麥品種之間ALS活性差異極為顯著。劉偉等[17]研究得出不同作物間甚至同種作物不同品種間對ALS抑制劑類除草劑的耐藥性均存在差異,不同品種小麥對啶磺草胺的耐受性同樣存在極顯著差異。最近的研究從分子水平上驗證了ALS基因的表達量變化及突變可以影響植物對除草劑的抗性[18～20],說明這也可能是一個有效的方法。我們在前期研究中發現：ALS基因存在組織表達特異性,在葉片中表達量最大,在4輪花器官(萼片、花瓣、心皮和雄蕊)均有表達,說明ALS參與植株發育,參與花器官的發育；在花瓣和雄蕊中表達最弱,表明雄蕊不易受影響。本研究嘗試在噴藥早期活體測定ALS的活性,通過比較對照與處理之間的差異來快速鑒定和預測殺雄劑苯磺隆的噴藥量是否達到合理范圍,結果表明在苯磺隆處理下2種油菜中的ALS活性均比對照顯著降低,ALS相對酶活分別為40.63%和37.23%,說明ALS活性的變化有可能作為快速鑒定和預測殺雄劑的噴藥量是否達到合理范圍的指標。但是前人的離體試驗研究表明：不同玉米品種對單嘧磺隆的敏感性有差異,單嘧磺隆對不同玉米品種ALS活性的影響存在差異,但對同一自交系玉米的ALS活性的影響差異不大；低濃度的單嘧磺隆可刺激活體ALS的活性,高濃度的則具有抑制作用[21]。因此要建立不同品種的ALS活性與不同藥劑噴藥劑量之間的函數關系需要植物品種特性、植株大小、ALS活性、藥劑吸收量等多年份的統計數據，這樣才能預測得到更為精準的殺雄劑合理施用劑量。