iTRAQ技術篩選急性心肌梗死動物血清早期潛在標記物的試驗研究

婁江杰 翁瑩政 曾廣忠 劉小偉 金紅峰 王亞利 杜常青 徐晨凱 唐禮江

急性心肌梗死（AMI）病情進展迅速，早期開通阻塞的冠狀動脈可以減輕心肌壞死，降低病死率，改善患者的預后，因此疾病早期的準確診斷至關重要。但是只有少數患者有典型的臨床表現，約50%沒有特異的心電圖改變[1]。目前快速有效的診斷方法是生化標記物的檢測，指南推薦的AMI診斷標記物為血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）和肌鈣蛋白，AMI發生后約 2～3h升高，24～48h達到高峰。這兩個標記物雖然有較高的靈敏度和特異度，但在AMI發生后的3h內診斷價值有限。因此尋找一種兼具特異度和靈敏度的AMI早期標記物極為迫切，而新型檢測技術的出現為此提供了可能。同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術是一種基于體外同位素標記的定量技術，該技術具備定量精確、低誤差、高效率、適用范圍廣等優點，是近年來定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術[2]。本研究采用8標iTRAQ技術聯用高分辨質譜技術，借助生物學信息分析手段，對動物發生AMI 6h內的血清樣本進行差異蛋白分析，旨在尋找潛在的AMI早期生物標記物，提高AMI的早期確診率。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 10～13個月齡健康比格犬32條，雌雄各半，體重10～12kg，均購自上海新岡實驗動物場[許可證號：SCXK（滬）2012-0009]。

1.2 試劑和儀器 甲酸銨、乙腈、BCA定量試劑盒由美國Thermo公司提供；胰蛋白酶購自美國Promega公司；聚乙烯微球懸浮制劑購自美國 Bangs Laboratories公司；凝血酶凍干粉由浙江杭康藥業有限公司提供；10kD超濾離心管購自美國Millipore公司；iTRAQ 8標試劑盒、TripleTOF質譜儀、C18上樣柱（Sciex POROS R2，100μm*4cm，10μm，2500A）購自美國AB SCIEX公司，高 PH 色譜柱 （Waters Xbridge 4.6×100mm column，5μm，200A）、C18分析柱（Waters Xbridge column，100cm，ID25μm，3.5μm，C18-A2）、C18 萃取柱、Waters NanoAcquity多維色譜儀由美國Waters公司提供；AKTA Purifier 100純化儀購自美國通用電氣公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組 采用隨機數字表法選取雌雄比格犬各1條，設為假手術組，其余30條犬設為AMI組。

1.3.2 比格犬AMI模型建立 比格犬穿刺股動脈行冠狀動脈造影，沿導絲送入預擴球囊至前降支第二對角支處，間隔30s行缺血預適應，撤出球囊，沿導絲送入微導管至前降支第二對角支遠端，經微導管快速注入聚乙烯微球懸浮制劑2ml，隨后注入凝血酶粉制劑2ml。間隔5～10min行冠狀動脈造影確認血流阻斷后，結束手術。假手術組只進行冠狀動脈造影，不注射聚乙烯微球懸浮制劑和凝血酶粉劑。

1.3.3 樣品的制備 于術前和術后1、2、3、6h抽取靜脈血，分離血清保存至-80℃冰箱備用。取血清樣品加入適量SDT裂解液，沸水浴15min。14 000r/min離心40min，取上清液。采用BCA法進行蛋白質定量。分裝樣品，-80℃保存。

1.3.4 蛋白樣品酶解及iTRAQ標記 各樣品取30μl裂解后的蛋白質溶液，采用超濾管酶解法進行酶解[3]。收集濾液，采用C18萃取柱對肽段進行脫鹽，肽段凍干后加入40μl復溶液復溶。各樣品分別取100μg肽段，按照AB SCIEX公司8標iTRAQ標記試劑盒說明書進行標記。假手術組用 113 標記，AMI組造模后 1、2、3、6h 樣本依次用 114、115、116、117 標記。

1.3.5 高pH-RP分級 將每組標記后的肽段混合，采用AKTA Purifier 100純化儀進行分級。色譜柱以A液（10mM 甲酸銨，5%乙腈，pH 10.0）平衡，B 液（10mM 甲酸銨，85%乙腈，pH 10.0）從0%到100%進行梯度洗脫，樣品由進樣器上樣到高pH色譜柱進行分離，流速為1ml/min。每隔2min收集洗脫組分，分別凍干后采用C18萃取柱脫鹽。

1.3.6 高效液相色譜分離及質譜分析 每份樣品采用Waters NanoAcquity多維色譜儀進行分離。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液。色譜柱以95%的A液平衡，樣品由自動進樣器上樣到C18上樣柱，經過C18分析柱分離，流速為5nl/min。樣品經色譜分離后用TripleTOF質譜儀進行質譜分析。

1.3.7 生物學信息分析用Mascot2.3和ProteinPilot 4.5進行查庫鑒定及定量分析。使用數據庫為Uniprot_Canislupusfamiliaris_29014_20160822.fasta。將符合表達差異倍數＞1.2倍（上下調）且P＜0.05篩選標準的蛋白質視為差異蛋白。分別對各個時間點鑒定到的差異蛋白進行基因本體（Gene ontology，GO）功能注釋和富集分析。

2 結果

2.1 4個不同時間點差異蛋白統計結果 為了盡量減少在實驗過程中產生的實驗誤差，一共進行了兩次質譜鑒定，共鑒定到肽段總數為4 541，唯一肽段數為4 082，蛋白質組數為691。對各時間點的數據進行分析，得到不同時間點的差異蛋白，見表1。

2.2 差異蛋白出現的時間點 對AMI 6h內的差異蛋白進行綜合分析，篩選AMI早期穩定變化的差異蛋白，并計算出各蛋白濃度和假手術組蛋白濃度的倍數關系。排除未命名蛋白和犬特有蛋白后，共發現15種AMI早期出現的差異蛋白，見表2。

表1 4個不同時間點差異蛋白統計結果（種）

2.3 差異蛋白GO功能注釋和富集分析 對各個時間點的差異蛋白進行GO功能注釋，使用Uniprot數據庫中動態更新的標準化詞匯描述差異蛋白顯著相關的生物學功能，并對注釋的結果進行富集分析，在4個時間點最顯著前30條（依P值從小到大排列）GO條目中，共發現7條共有條目，分別是氧氣運輸、氣體運輸、血紅蛋白復合體、氧氣結合、蛋白復合體、亞鐵血紅素結合、四吡咯化合物結合。對篩選出的差異蛋白的GO條目進行分析，羅列出至少三個差異蛋白共有的條目，見圖1。鑒定出的15種差異蛋白涉及的主要生物學過程為細胞代謝，最主要的分子功能為蛋白結合，大部分蛋白定位于胞內的細胞器。

表2 差異蛋白出現的時間點

圖1 差異蛋白GO富集分析（注：藍色代表生物學過程，黃色代表分子功能，綠色代表細胞組分）

3 討論

AMI發病后1h內得到救治，病死率約為1%，發病6h后得到救治，病死率則高達10%～12%，因此尋找早期診斷AMI的標記物具有重要的臨床意義[4]。目前有文獻報道的AMI早期潛在標記物包括P-選擇素、α-肌動蛋白、碳酸酐酶Ⅲ、脂肪酸結合蛋白等十余種，但臨床價值有限[5]。iTRAQ技術可以尋找差異蛋白，并分析其蛋白功能，同時可以對1個基因組表達的全部蛋白質或1個混合體系中的所有蛋白質進行精確定量和鑒定[6]。目前利用iTRAQ技術研究各種疾病的診斷標記物已成為熱點。

利用iTRAQ技術，本研究對不同時間點差異蛋白進行綜合分析，重點篩選出了15種在AMI后6h內出現的差異蛋白。通過對這15種差異蛋白進行進一步的生物信息學分析，亞細胞定位顯示，在細胞器內，細胞質，細胞外基質，細胞膜上均有差異蛋白的表達。功能分析則表明這些差異蛋白具有結合、催化和水解酶活性等重要作用，并參與代謝、對刺激的反應、生物調節、定位等生物過程。

肌球蛋白是一種馬達蛋白，屬于超家族蛋白，種類龐大，目前一共發現24種[7]。肌球蛋白可以通過ATP供能，在肌動蛋白上滑動，進而發揮多種功能，如細胞器運輸、有絲分裂和細胞移動[7]。有研究表明，MYO1A在保持細胞膜的張力中起關鍵性作用[8]，同時也是腸微絨毛刷狀緣的重要組成成分[9]。MYO18A在維持高爾基體的定位中起作用，還是細胞骨架和膜表面受體的組成成分[10]。總的來說，肌球蛋白功能復雜，而且不同的肌球蛋白亞型之間，功能差別較大。有研究認為肌球蛋白輕鏈在AMI后3～6h內升高，可以作為AMI早期標記物[5]，間接支持了MYO1A和MYO18A有作為AMI早期標記物的可能性。

APOE、APOF主要由肝臟合成，血管壁的巨噬細胞也可以部分合成APOE，它們的主要作用是調節血脂濃度，其對動脈粥樣硬化的保護作用已得到公認。越來越多的研究證明，APOE還可以調節免疫功能，調控細胞生長和分化[11]，而且這些作用獨立于APOE的脂類運輸作用。血小板激活是急性心肌梗死發生的關鍵性病理變化，APOE能刺激血小板合成NO，抑制血小板聚集[12]。國內也有一些文獻報道AMI患者APOE的濃度較對照組升高。

本研究雖然還發現了一些AMI早期出現的差異蛋白，由于目前沒有相關研究證明這些差異蛋白和心肌相關，作為AMI早期診斷標記物的潛力不大。例如CA2是一種能催化二氧化碳和水生成碳酸氫根和氫離子的金屬酶，分布廣泛，與多種病理及生理活動相關，雖然在AMI后1h就開始持續升高，但有研究證明多種腫瘤疾病如鼻咽癌患者[13]，CA2也會升高，這影響了CA2診斷AMI的特異度。FN1是血小板α顆粒成分之一，參與了血小板黏附聚集的過程，可能在AMI的病理變化中發揮一定的作用，但有研究證明FN1和腫瘤相關，也不首選作為進一步研究的對象[14]。CTSG主要在炎癥反應中起作用，還可以降解細胞外基質和激活血小板[15]，在AMI后1h就開始持續降低，可能也在AMI的病理變化中起一定作用。

總之，本研究利用iTRAQ技術篩選比格犬AMI早期生物標記物，對篩選出的差異蛋白進行功能分析并查閱相關文獻，發現MYO1A和MYO18A作為AMI早期標記物有一定的可行性，有深入研究的價值。本研究主要的不足之處是沒有對篩選出的差異蛋白進行驗證，結果的臨床價值還有待證實，進一步的研究將對篩選出的15種差異蛋白進行驗證，尤其對MYO1A和MYO18A進行重點研究。