JAK2 V617F、DNMT3A、NPM1和FLT3-ITD基因突變與骨髓增殖性腫瘤預后的相關性分析*

張葉華 郭素麗*

骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms，MPN)多能造血干細胞或祖細胞以一系或多系分化相對成熟的骨髓細胞克隆性增殖異常為特點的一組異質性疾病[1]。臨床主要以“脾大”為主要體征，以血細胞異常增多且在細胞形態與功能上接近正常細胞為主要血液學特征。2008年，世界衛生組織(World Health Organization，WHO)將慢性髓性腫瘤增殖區分為真性紅細胞增多癥(polycythemia vera，PV)、原發性血小板增多癥(essential thrombocytosis，ET)、慢性髓細胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)以及原發性骨髓纖維化(primary myelofibrosis，PMF)等多種亞型，并更名為“MPN”，以強調其是一種惡性克隆性疾病。

近年來，隨著基因下一代測序(next generation sequencing，NGS)技術進入臨床應用，已發現MPN患者存在多種不同基因突變。目前，JAK2 V617F是在MPN患者各亞型中檢出突變率較高的基因，PV患者中突變率達97%～99%，在ET及PMF患者中達80%～90%，對于MPN患者具有較為顯著的相對特異性，WHO已將之列為常規基因突變檢查[2]。此外，近年來也相繼發現MPN患者還存在較少見DNMT3A突變，NPM1和FLT3-ITD基因突變等。ET、PMF及CML等亞型可能均為PV的變異病型[3-4]。在疾病轉歸的相互依賴關系以及對于預后的影響，尚缺乏更多的相關研究報道予以支持。本研究回顧性分析80例MPN患者的基因突變譜情況，旨在探討JAK2 V617F、DNMT3A、NPM和FLT3-ITD基因突變與MPN患者預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月至2017年3月邢臺市人民醫院收治的80例MPN患者，其中男性48例，女性32例，年齡26～52歲，平均年齡(55.48±12.52)歲，依據WHO診斷與分類標準(2008版本)，患者在初診時均獲得明確診斷，其中PV為19例，ET為31例，PMF為18例，CML為12例。根據核型分析結果將80例患者分為預后良好組(36例)、中度風險組(22例)及不良風險組(22例)。

1.2 納入與排除標準

(1)納入標準：①所有患者經臨床檢查均為MPN；②患者最初治療時肝腎功能未超過正常值上限1.5倍；③患者及家屬均知情同意且簽署知情同意書。

(2)排除標準：①凡合并有其他血液系統疾病或既往有過MPN相關性治療史的患者；②患者合并重要臟器、眼中出血和血栓危及生命者。

1.3 血液學檢查

所有患者均行血液學檢查，凡合并有其他血液系統疾病或既往有過MPN相關性治療史的患者均予以排除。對所有患者骨髓及外周血標本均行NGS測序以及對所有患者均行細胞遺傳學檢查、染色體核型分析等。

1.4 基因檢測

利用NGS對與MPN發病常見的18個相關基因進行靶向測序，分別為FLT3-ITD、KIT、JAK2、NRAS、KRAS、MPL、CBL、NPM1、RUNX1、LNK、WT1、TP53、DNMT3A、IDH1、IDH2、TET2、SRSF2、U2AF1。

骨髓或外周血基因分析使用美國Thermo Fisher Scientific公司研發的Ion Torrent PGM平臺進行。靶基因擴增引物設計采用美國Life Technologies公司研發的Ion AmpliSeq Designer軟件，確定聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)的具體反應條件及NGS測序步驟。采用美國Invitrogen公司生產的QIAamp DNAKit提取DNA。每份標本提取20 ng的DNA用于NGS檢測。進行測序的PGM測序儀購于美國Life Technologies公司，測序覆蓋率評估使用美國Thermo Fisher Scientific公司研發的Coverage Analysis軟件(版本3.2.1)，原始序列讀數鑒定采用美國Broad Institute研究所生產的Integrative Genomics Viewer軟件進行。確定基因變異參考公共數據庫[COSMIC(http：//cancer.sanger.ac.uk/cosmic/)和dbSNP(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)]。

1.5 MPN患者細胞遺傳學分析

采用染色體核型分析和熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技術進行MPN患者細胞遺傳學分析。

(1)染色體核型分析。收集MPN患者外周血或骨髓抽吸/活檢標本80例，均使用常規R顯帶技術，參照標準細胞遺傳學核型分析，檢查分裂中期細胞≥20個。

(2)FISH技術分析。采用5q EGR1(5q31)、D7S486(7q31)、CEP 8(SA)、D20S108(20q12)、MLL(11q23)break-apart和TP53(17p13.1)探針組合進行FISH技術分析。

1.6 統計學方法

使用SPSS 19.0軟件對數據進行統計處理。對分類變量比較行x2檢驗。患者生存期分析根據Kaplan-Meier生存曲線進行，總體生存期從初診第1 d開始計算，直到死亡(任何原因)或最終隨訪結束為止。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各亞型之間檢測項目兩兩比較

各檢測項目不同亞型之間兩兩比較，差異均有統計學意義(t=9.168，t=10.273，t=8.532，t=9.065；P＜0.05)。見表1。

表1 MPN患者各亞型血液學檢測項目比較(±s)

表1 MPN患者各亞型血液學檢測項目比較(±s)

注：表中PV為真性紅細胞增多癥；ET為原發性血小板增多癥；PMF為原發性骨髓纖維化；CML為慢性髓細胞白血病；HB為血紅蛋白；RBC為紅細胞；WBC為白細胞；PLT為血小板。

類型 例數 HB(g/L) RBC(×1012/L) WBC(×109/L) PLT(×109/L) t值 P值CML 12 98.86±10.56 3.17±0.92 86.11±7.53 557.45±122.62 9.168 ＜0.05 ET 31 116.20±11.22 3.16±0.86 10.68±2.62 817.60±120.50 10.273 ＜0.05 PMF 18 115.34±10.52 5.62±0.78 27.48±3.21 1635.22±221.00 8.532 ＜0.05 PV 19 193.00±23.56 7.34±1.02 13.28±2.44 500.60±50.17 9.065 ＜0.05

表2 MPN患者各亞型全基因組首次檢測結果(例)

2.2 染色體核型分析

染色體核型分析結果為：①19例PV患者中12例正常核型，7例異常核型，異常核型主要為+8、+9、del(20 q)、del(13 q)及del(9 q)，其中1例+8和+9同時存在；②31例ET患者中28例正常核型，3例異常核型，異常核型為+8、9 q和20 q-等；③18例PMF患者中5例異常核型，13例正常核型，異常核型除5例為異常核型外，其余均為正常核型，異常核型為del(13)(q12-22)、der(6)t(1；6)(q21-23；p21，3)、del(20 q)、+1q、+8及+9等；④12例CML患者中5例正常核型，5例異常核型，異常核型為50，XY，+3，add(6)(p23)，+add(6)(p23)，+9，+21(5)/46，XY，+8，+9(3)/46，xy(7)；Ph染色體異位，核型為46，XY(XX)，t(9：22)(q34：q11)，復雜核型的Ph染色體2例，核型為46，XX，t(9：22：11)(q34：q11：q14)。

三組主要核型均包括有正常核型與異常核型，其中不良風險組還包括復雜核型的Ph染色體2例，核型為46，XX，t(9：22：11)(q34：q11：q14)。

2.3 R顯帶技術及NGS檢測情況

在三組MPN患者中，預后良好組的26例患者PV、ET、PMF及CML各8例、12例、4例和2例；中度風險組32例患者PV、ET、PMF及CML各4例、17例、6例和5例；不良風險組22例患者PV、ET、PMF及CML各7例、6例、4例、5例。

排除陽性，隨訪中末次從陰性中檢測到陽性結果。采用NGS技術對MPN初診患者與MPN發病相關的18種基因靶向測序，80例患者檢出JAK2 V617F突變陽性61例，突變率為76.25%，主要見之于PV、ET及PMF亞型患者中，突變率分別為89.47%、74.19%和50%；在CML中檢出1例，突變率為8.33%。檢出DNMT3A突變陽性10例，突變率為12.5%，但主要分布于CML患者中，檢出NPM1突變陽性10例，突變率為12.5%，檢出FLT3-ITD突變陽性6例，突變率為7.5%，主要分布于CML患者中。各相關基因的檢出情況及相關基因變異在各風險組中的分布情況見表2。

2.4 MPN患者基因突變譜分析

采用NGS靶向測序，80例MPN患者中，最少發生1個基因突變有73例，突變率為91.25%；多基因(≥2)突變有49例，突變率為61.25%，在中等風險組中分布最高，發生18例，多基因突變率為81.81%。排除陽性，從陰性患者中再次采用NGS靶向測序，檢測出JAK2 V617F突變、DNMT3A突變、NPM1突變與FLT3-ITD突變情況見表3。測序分析以NMP1為例，如圖1、圖2所示。

表3 排除陽性四種基因突變檢測結果(例)

圖1 直接測序篩選NPM1基因突變結果

圖2 NPM1基因A型突變克隆測序結果

表4 MPN病型變異在不同風險組中的分布

表5 四種基因突變陽性組與陰性組總生存期比較(±s)

表5 四種基因突變陽性組與陰性組總生存期比較(±s)

基因突變 陽性 陰性 t值 P值JAK2 V617F突變(生存期 月) 22.86±8.34 23.52±7.28 22.345 0.873 DNMT3A突變(生存期 月) 18.38±14.35 18.72±14.48 18.436 0.782 NPM1突變(生存期 月) 16.38±10.27 18.32±11.46 8.342 0.689 FLT3-ITD突變(生存期 月) 20.48±12.36 20.48±12.36 13.452 0.722

2.5 基因突變與疾病轉歸之間的關系

80例MPN患者基因突變與疾病轉歸之間的關系：①19例PV患者中轉為ET的2例(占10.52%)，轉為PMF的2例(占10.52%)；②31例ET患者中轉為PMF的3例(占0.09%)；③18例PMF患者中轉為CML的3例(占16.67%)，另有1例轉為急性白血病。對上述病例檢測出基因突變情況及在不同風險組中的分布見表4。

2.6 JAK2 V617F突變、DNMT3A突變、NPM1突變與FLT3-ITD突變與MPN患者總生存期的關系

80例患者均獲3年隨訪，JAK2 V617F突變、DNMT3A突變、NPM1突變與FLT3-ITD突變陽性與陰性總體生存期比較，差異均無統計學意義(t=22.345，t=18.436，t=8.342，t=13.452；P＞0.05)，與MPN預后無明顯相關性(見表5)。

Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示，在MPN亞型PMF病例中，JAK2 V617F突變陽性+NPM1突變陽性患者，中位生存期明顯短于陰性，差異有統計學意義(t=11.086，P＜0.05)，提示預后不良。與單獨陽性組、單獨陰性組及雙陰性組比較，差異均有統計學意義(t=9.637，P＜0.05)，患者多預后不良。在CML中度風險組患者中，FLT3-ITD突變陽性+DNMT3A突變組的總生存期明顯短于FLT3-ITD突變陰性組和FLT3-ITD突變陽性+DNMT3A野生型。因此，AML患者是否同時發生DNMT3A突變能夠顯著改變FLT3-ITD的預后效應。

3 討論

MPN是造血干細胞或祖細胞在向一系或多系分化過程中導致血細胞異常增殖的一組異質惡性克隆性疾病，主要包括PV、ET、PMF以及CML等幾種亞型。在MPN的疾病進程中，可發展為骨髓纖維化，并最終進展為白血病[6]。患者生存期范圍較廣，從短至數月至數年，甚至20年以上。MPN的預后因素較為復雜，包括病型、年齡、性別、細胞遺傳學、染色體核型、基因突變等多種因素。

近年來，隨著全基因組測序進入臨床使用，發現與MPN發病相關的基因已越來越多。基因突變不僅是MPN在不同階段病情進展的標志，還可能是MPN預后的重要標志[7]。目前，除已發現JAK2 V617F是MPN患者存在較高突變頻率的基因，DNMT3A、NPM1及FLT3-ITD也是MPN較為重要的常見基因。但以往臨床研究較多集中于對基因突變的隨機事件報道，可能存在的聯系以及與MPN預后的相關性。馬娟等[8]研究顯示，MPN中亞型ET和PMF均為PV的變異病型，各亞型是否為同一種疾病的不同發展階段，不同的基因突變事件是否在MPN的病型變異發展中存在聯系，可能均為在評估預后上需要重點考慮的因素。

本組研究中，采用NGS靶向測序技術，從MPN的基因突變譜分析其結果顯示，80例患者中有73例最少可檢測到1個基因突變，占91.25%，有49例檢測到最少有2個以上的多基因突變，占61.25%。提示基因突變≥2模式為MPN患者基因突變的主要模式。其中，JAK2 V617F突變率最高，主要見之于PV、ET、PMF等亞型，與以往報道相符[8]。但DNMT3A、NPM1及FLT3-ITD在MPN中只存在較低的基因突變率，主要出現在CML患者中。而進一步分析表明，JAK2 V617F、DNMT3A、NPM1及FLT3-ITD突變在MPN患者的陽性與陰性總生存期比較，差異均無統計學意義，與MPN預后并無明顯相關性。但進一步對MPN亞型展開分析，在JAK2 V617F陽性的ET和PMF患者中，轉為白血病的幾率較高，患者生存期均較短，而在JAK2 V617F陰性的中度風險組的CML患者中，FLT3-ITD同時伴NPM1或DNMT3A基因突變，會帶來不同的預后結果。FLT3-ITD同時伴NPM1基因突變，多提示預后不良，與以往報道的NPM1陽性，預后良好的結論有所不同[9]。FLT3-ITD同時伴DNMT3A基因突變，能產生預后效應。

本研究通過分析MPN各亞型基因突變數據發現，JAK2 V617F、DNMT3A、NPM1及FLT3-ITD等基因突變均可能是MPN疾病進展階段性的重要基因突變事件，能否產生預后效應，與其標志的MPN病情進展階段及嚴重程度有關。這可能為JAK2 V617F、DNMT3A、NPM1及FLT3-ITD中任一單獨基因突變，與MPN患者總體生存期的相關性表現并不明顯的原因。基因突變并非孤立性事件，自JAK2 V617F基因突變發現后，已成為JAK2 V617F陽性MPN發生的病理基礎[10]。JAK2突變可能為MPN發病的關鍵性基因，JAK2為JAK基因家族成員之一，編碼位于胞漿的酪氨酸激酶組蛋白，而JAK家族是指導轉錄的重要基因，通過JAK-STAT途徑參與細胞表面多種受體特別是多種細胞因子的信號傳遞。更為重要的是，多種細胞因子也均是通過這一途徑參與對細胞增殖和分化調控，而其中的JAK2就與造血祖細胞多種高敏感性生長因子的信號轉導有關，包括干細胞因子(SCF)、紅細胞生成素(EPO)、以及血小板生成素(TPO)、粒細胞巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素3(L-3)等。而JAK2基因突變，造成基因功能性喪失或破壞，也可能會引起與之關系密切的編碼其他生長因子的基因突變，最終導致各種異質性克隆性MPN亞型克隆性疾病發生。而JAK2高頻率突變為JAK2 V617F突變，在MPN的亞型PV、ET及PFM患者中均檢測到JAK2 V617F較高陽性發生率，究其原因，也可能在于JAK2 V617F突變引發與之相關的造血祖細胞的不同生長因子的正常功能不同程度受到影響，從而出現各種MPN亞型。DNMT3A是與甲基化有關的基因，調節轉錄沉默。馬麗麗[11]研究證實，單獨DNMT3A基因突變，并不足以導致白血病發生。而NPM1編碼核質穿梭的核磷蛋白是保守基因，具有較好穩定性，在核糖體合成、維持基因穩定以及調控抑癌基因的活動性與穩定性等多種細胞生物活動過程，具有重要作用。FLT3-ITD基因是與造血因子有關的基因，通過編碼酪氨酸激酶II系組蛋白，調控細胞增殖與生長[12]。鑒于DNMT3A與NPM1基因在細胞功能結構域中的重要地位與作用，DNMT3A和NPM1基因突變，可能表明DNA基因受累已在移向核心功能結構域，疾病已進展到嚴重階段。上述3種基因突變在PV、ET及PMF患者中存在極低發生率或不能檢測到陽性，可能與疾病還未進展到這一階段有關。而在CML患者中，均能檢測到上述3種基因突變陽性，可能與基因受累的嚴重程度有關，提示MPN可能已進展到相當嚴重程度，引發多種基因突變協同作用，最終促使白血病形成。而幾乎臨床上所有PV、ET、PMF等MPN亞型最終均能發展為白血病，也對此予以證實[13]。

本組研究中，多基因突變模式在中度風險組較為常見，但所導致的MPN嚴重程度可能還與是否引起位于細胞核心功能結構域的基因突變有關。在核心功能結構域的基因發生突變事件，對于功能系統的破壞程度可能是致命的。而在CML中度風險組患者中，檢測出FLT3-ITD伴DNMT3或NPM1同時突變發生率較高，為40%，患者多預后不良，亦可證實位于核心功能結構域的多基因受累是導致患者預后不佳的原因。

王彥麗等[14]研究表明，MPN病型變異對于MPN原發病進展走向具有重要影響，與預后評估密切相關。有研究顯示，ET和PMF均為PV的變異病型，可能為同一種疾病在不同發展階段的表現，但缺乏足夠的證據支持。雖然在MPN的亞型PV、ET及PMF能檢測到較高發生率的JAK2 V617F陽性突變，但在CML患者中，并不能檢測到JAK2 V617F陽性突變。以往研究較多集中于孤立基因突變的隨機事件，很少涉及不同基因突變事件之間可能存在的聯系，自JAK2 V617F、DNMT3A、NPM1以及FLT3-ITD基因突變在MPN患者中相繼發現后，目前并無上述基因突變可能存在的相互影響，對MPN的變異病型是否為同一種疾病受基因突變事件相互影響所導致的在不同階段的表現，缺乏進一步的深入了解。

本研究對于MPN各亞型的變異病型給予了在基因突變事件上可能存在的關聯性上的數據分析，發現了11例原發MPN向其他亞型變異，發生率為13.75%。其中PV→ET2例；PV→PMF2例，ET→PMF3例，PMF→CML3例，此外，有1例為MPN激變期發展為急性白血病。發現3例CML變異病型均存在于JAK2 V617F陽性率較高的PMF患者中，且在原發病患者中均存在伴DNMT3或NPM1基因突變。證實了ET、PMF等亞型可能為PV的變異病型的結論。對上述病例均再次進行基因檢測，3例NPM1陰性原發PMF病型變異為CML的患者，檢測到NPM1突變陽性，1例原發PV檢測到DNMT3A陽性，1例原發PV、3例原發ET，檢測到FLT3-ITD陽性。提示，在原發病患者中陰性基因可能存在潛在突變風險，可能是導致病型變異的原因。

因此，JAK2 V617F突變、DNMT3A突變以及NPM1與FLT3-ITD突變是否具有預后效應，還要看與之相聯系的基因突變事件對于MPN在疾病進程階段及發展走向上的影響。本研究中，在CML中度風險組中，FLT3-ITD只有同時伴DNMT3A或NPM1突變，才能產生預后效應，多提示患者預后不良，而在JAK2 V617F突變陽性的PMF患者中，同時伴NPM1突變，多提示預后不良。異常核型出現的NPM1基因突變，在以往研究中認為是預后良好的標志基因，本研究認為可能只是對于病理損傷的基因突變在自我修復過程中出現的防御性反應結果。而在正常核型的NPM1突變，則可能是NPM1基因嚴重受累所導致的異常，往往提示基因病理損傷已在向核心功能結構域轉移。

由于本研究并未檢測JAK2在其他位點的基因突變，如第12號外顯子突變，以及近年來發現的基因JAK2 V617F陰性患者存在的MPL基因突變，也可能是導致MPN的發病基因，對于NPM1亦只檢測了第12號外顯子突變情況，基因突變可能存在多個位點突變，對于未知基因以及其他位點的基因突變未予以考慮，導致相關基因未能檢測到，這也是本研究的局限之處。對于在CML患者中未能檢測到JAK2 V617F突變，是否存在另外位點或未知基因突變，亦不能加以說明，因此，對于JAK2 V617F、DNMT3A、NPM1和FLT3-ITD在MPN患者中的預后價值，尚需臨床上進一步研究予以證實。