全自動生化分析儀檢測尿17-酮類固醇的性能評價

程 勇 劉辰庚 張麗春 趙萍萍 王紅彥 王培昌*

尿中17-酮類固醇(17-ketosteroide，17-KS)是腎上腺皮質與睪丸及卵巢某些類固醇激素代謝產物，可反應腎上腺皮質激素、糖皮質激素及性腺分泌總的情況，對于評價腎上腺分泌雄激素的功能具有一定的價值。多年來，17-KS的臨床檢測方法主要為分離柱色譜法，但操作步驟繁瑣、費時且費力，不適合大批量的快速檢測，不能滿足檢驗專業快速及準確的要求[1]。

2017年，原國家食品藥品監督管理局(State Food and Drug Administration，SFDA)首次批準了用于生化分析儀的17-KS檢測方法及試劑盒，基于此，本研究分析評價該方法的檢測性能及其與傳統手工方法檢測結果的一致性及臨床應用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年5-9月首都醫科大學宣武醫院收治的50例高血壓患者將其納入高血壓組，其中男性25例，女性25例，平均年齡60歲；選取30例嗜鉻細胞瘤患者將其納入嗜鉻細胞瘤組，其中男性15例，女性15例，平均年齡59歲；選取30例庫欣綜合癥患者將其納入庫欣綜合征組，其中男性15例，女性15例，平均年齡59歲；另隨機抽取30名健康受試者作為健康對照組，其中男性15名，女性15名，平均年齡60歲；隨機選取30名高血壓待確診患者作為待確診組，其中男性15名，女性15名，平均年齡38歲。本研究內容已經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 納入與排除標準

(1)納入標準：①高血壓患者滿足《中國高血壓防治指南》的診斷標準；②嗜鉻細胞瘤患者滿足《腎上腺嗜鉻細胞瘤的診斷與治療指南》的診斷標準；③庫欣綜合征患者滿足《庫欣綜合征治療的臨床實踐指南》的診斷標準；④健康對照組生長發育正常，心臟、肝臟、腎臟和腦不存在其他疾病，未服用其他神經、精神類藥物及其他治療性藥物；⑤待確診患者為有高血壓癥狀，但排除嗜鉻細胞瘤和庫欣綜合征者。

(2)排除標準：①心臟、肝臟、腎臟和腦存在其他疾病；②服用其他治療性藥物者。

1.3 儀器與材料

(1)儀器設備。7600全自動生化分析儀(日本日立公司)，該試劑盒為液體雙試劑，按照試劑盒說明書在日立7600儀器P模塊設置反應條件并操作；722 s型紫外可見分光光度計(上海析譜儀器有限公司)，檢測時儀器處于正常的維護、保養和檢定狀態。

(2)試劑盒材料。分離柱色譜法尿17-KS檢測試劑盒(西班牙Bio-System公司)；均相酶免疫法尿17-KS檢測試劑盒(蘇州博源醫療科技有限公司)。

1.4 檢測方法

(1)樣本采集與處理。5組受試者按照《全國臨床檢驗規程第四版》的要求準確留取24 h尿液，經5 L帶刻度燒杯精確測量尿量，混合均勻用帶帽10 ml離心管留取8 ml尿液，于離心機上3000 g離心5 min，上清置于新的帶帽離心管2～8 ℃保存，3 d內檢測完畢。

(2)手工法。采用分離柱色譜法，試劑盒批號：REF11002、LOT17953，校準品LOT127XA，校準品稀釋液LOT126XA，質控品LOT142XA，質控品稀釋液LOT142XA。由具有中級專業職稱且長期從事17-KS檢測工作的人員按試劑說明書進行實驗。

(3)生化法。均相酶免疫法尿17-KS檢測試劑盒，試劑盒批號：Lot#170327，校準品Lot#170327，質控品Lot#170327。

1.5 觀察及評價指標

(1)正確度驗證。①分別使用兩種方法檢測第三方定值質控品(BIO-RAD LOT63360)3次，計算平均值與相對偏差；②分別使用兩種方法學試劑檢測兩種試劑盒的配套校準品(選3個濃度)3次，計算平均值與相對偏差。

(2)精密度驗證。①批內精密度，選取2個尿液樣本連續檢測20次，計算批內精密度(CV%)；②批間精密度，選取2個尿液標本上午測2次，下午測2次，連續檢測5 d。

(3)線性范圍。①手工法，將尿液標本加入標準物質至試劑盒標示的線性范圍上限，做比例稀釋，將理論值和實測值進行線性回歸，計算相關系數；②生化法，用尿液標本將試劑盒中高濃度17-KS質控至試劑盒標示的線性范圍上限，做比例稀釋，將理論值和實測值進行線性回歸，計算相關系數。同時，利用本組數據使用線性回歸計算兩種方法的相關性，使用t檢驗明確其有無統計學差異。

(4)干擾試驗。①分別使用膽紅素、血紅素、甘油三酯、血紅蛋白、白蛋白和抗壞血酸進行抗干擾試驗，在質控品中加入一定量的干擾物質達到相應濃度；②計算檢測試劑濃度與理論濃度的偏倚(%)。因Bio-System試劑盒未給出抗干擾的指標范圍，故使用博源公司試劑盒給出的抗干擾指標進行試驗。

(5)受試者陽性率。使用以上兩種試劑盒檢測疾病和健康受試者的17-KS，統計其檢測結果的一致性和陰陽性率等診斷性能指標。

1.6 統計學方法

使用SPSS 18.0統計軟件對數據進行統計分析。組間數據使用兩樣本t檢驗進行組間檢測結果的統計學分析；同一受試者不同檢驗方法的數據比較使用配對t檢驗；率的比較使用x2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢測方法正確度驗證結果

使用手工法和生化法檢測BIO-RAD的相對偏差分別為8.43%和4.23%，手工法高于生化法。兩種方法檢測各自配套校準品的偏差均相對較小，檢測非配套校準品的偏差相對較大，但偏差均＜15%，見表1。

表1 兩種檢測方法正確度相對偏差驗證結果(%)

表2 兩種檢測方法干擾試驗結果(%)

表3 兩種檢測方法臨床驗證結果(%)

2.2 兩種檢測方法精密度驗證結果

手工法的批內精密度為7.44%，生化法的批內精密度為3.99%；手工法的批間精密度為13.18%，生化法的批內精密度為5.22%；生化法優于手工法。

2.3 兩種檢測方法線性范圍和相關性驗證結果

手工法線性范圍(0～120 mg/L)達到說明書要求，相關系數r=0.967，P＜0.05；生化法線性范圍(0～120 mg/L)達到說明書要求，相關系數r=0.999，P＜0.05，生化法線性范圍相關系數優于手工法。兩種方法的檢測結果相比，差異無統計學意義(r=0.92，P＞0.05)，具有良好的相關性。

2.4 兩種檢測方法干擾實驗結果

干擾實驗生化法試劑盒在其試劑盒說明書給定的范圍內其檢測性能指標良好，在膽紅素≤40 mg/dl、血紅素≤500 mg/dl、甘油三酯≤1000 mg/dl、血紅蛋白≤1000 mg/dl、白蛋白≤1000 mg/dl和抗壞血酸≤10 mmol/L的情況下偏倚≤10%，手工法試劑盒其抗干擾性能低于生化法，見表2。

2.5 兩種檢測方法臨床驗證結果

兩種檢測方法對5組進行臨床驗證，生化法檢測嗜鉻細胞瘤陽性率高于手工法，其差異有統計學意義(x2=4.59，P＜0.05)，參考臨床診斷得知生化法準確率高于手工法；兩種方法檢測高血壓腎上腺腫瘤、待確診患者和健康對照組陽性率和陰性率一致，見表3。

3 討論

腎上腺皮質球狀帶分泌過多鹽皮質激素和糖皮質激素，還可分泌過多的性激素(睪酮)，17-KS為睪酮的代謝產物，增高提示腎上腺腫瘤時激素及其代謝產物的改變[2]。分泌過多的皮質醇，引起庫欣氏綜合征。過多的睪酮和皮質醇引起17-KS的大副增高[3]。17-KS的檢測也可用于腎上腺腫瘤術后的療效觀察，術后1個月所有患者血清皮質醇、醛固酮、17-OH、17-KS、VMA以及血清兒茶酚胺均正常[4]。故而檢測17-KS，對于上述病病的診斷與治療有一定的參考意義。

由于17-KS屬于小分子代謝物，使用傳統的生化和免疫方法難以對其進行有效的檢測，故長期以來，大部分實驗室均使用抽提法或分離柱色譜法進行手工檢測。但隨著國家對試劑耗材注冊證制度的不斷嚴格，使臨床實驗室對17-KS的檢測試劑盒的選擇僅能在有限的幾種進口品牌中選擇，但均為手工方法。

隨著醫療技術的不斷發展，對于疾病的診斷、治療及監測提出越來越高的要求，臨床檢驗的領域也有了飛速的進步，方法學不斷推陳出新。以往不可能完成的檢測現在都在不斷被實現。臨床醫生對腎上腺相關疾病的病因及治療可以有多種輔助方法確證，而尿液17-KS作為輔助診斷依據的一種，導致臨床實驗室的相關標本量不斷擴大，這對于17-KS一類僅能進行手工法檢測項目的檢測壓力不斷增加，許多實驗室出現了須有專人從事17-KS等項目手工檢測的情況，不符合臨床實驗室定量檢測項目自動化、標準化和精密化的發展趨勢[5]。腎上腺皮質疾病的診斷和治療中，生化檢驗作為近幾年腎上腺皮質疾病診斷中的一種新技術，在臨床上應用的越來越廣泛，發揮的作用也愈發明顯[6]。在此背景下，可在生化儀檢測17-KS的試劑盒應運而生。

經本研究實驗室的方法學評價，生化法的17-KS檢測試劑盒其正確度、精密度均優于手工法，且其正確度和精密度的實測值已經達到了常規化學中其他小分子項目如肌酐、尿素等的國標要求，表明其檢測精度能滿足臨床的診治需求，并對個體內變異進行有效區分。尿液的顏色多變，以色譜法為基礎的手工法17-KS檢測較易受色素的影響；但以均相免疫法為基礎的生化法檢測則對尿液的顏色抗干擾能力較強[7]。

本研究實驗表明，在模擬血尿、膽紅素尿、蛋白尿和使用大量水果或維生素人群標本的抗干擾試驗中，生化法的抗干擾能力優于手工法。在疾病診斷異常率方面，兩者具有大體相似的性能；但在臨界值處的檢測結果方面，由于生化法具有更好的正確度和精密度，故其對這類患者的診斷更有優勢。

色譜法雖然是檢測17-KS的較好方法，但目前國內尚無經SFDA頒發注冊證的色譜儀法的17-KS檢測系統。在此背景下，我國試劑廠家率先研制出以均相酶免疫為方法學的17-KS檢測試劑盒，該試劑盒于2017年3月15日獲得SFDA的批準也使其成為了國內首個能進行17-KS自動化檢測的試劑盒。均相酶免疫技術的最大技術優勢是檢測藥物、激素、有機物等小分子物質，17-KS即為其中一種。其技術核心是將具有生物學活性的半抗原(即待測小分子)與生物酶經交聯劑結合成酶標記的半抗原，同時暴露半抗原的抗原表位使其保留半抗原的抗原性，暴露酶的活性中心以保持酶的活性。當酶標記的半抗原與相應的特異性抗體結合后，由于空間位阻、蛋白質相互作用或者共價鍵的形成，使所標記的酶與抗體密切接觸，覆蓋或影響酶活性中心的結構使酶全部或部分失活。待測標本中的待測小分子也是有活性半抗原，故能與反應體系中的生物酶標記的半抗原共同爭奪抗體并與之結合。由于反應體系中抗體的量是一定的，如待測樣本中的待測物濃度越高，則其競爭性結合的抗體量越大，導致與生物酶標記半抗原結合的抗體量減少，生物酶活性受抑制的程度降低，故從酶活力的測定結果就可推算出標本中待測物含量[8]。

目前，臨床實驗室使用均相酶免疫分析技術作為方法學的檢測項目相對有限，對于大部分小分子的檢測，均以化學發光法、電化學發光法和微粒子酶免疫法為主。同時，上述檢測項目多為在配套檢測系統上進行，具有較好的溯源性、正確度和特異性。對于本研究所使用的均相酶免疫分析技術而言，由于其使用了開放系統，可在任意全自動生化儀上進行檢測，故對其進行方法學確認實驗，以保證檢測結果的有效性和可靠性就尤為重要。同時，24 h尿液17-KS檢測的生物參考區間相對其他激素類項目而言更加狹窄，故在生物參考區間邊緣的樣本檢測的正確性和穩定性更值得關注。但由于均相酶免疫法的技術核心是抗原抗體反應，其要求的pH值環境和離子條件較色譜法嚴格，故在一些酸性尿、堿性尿和嚴重腎臟病患者的尿液中其可能出現不可預知的檢測偏差，應引起實驗室工作人員和臨床醫生的重視[9]。

4 結語

用于生化分析儀的17-KS檢測方法，較傳統的手工法具有更好的檢測性能和更大的臨床應用價值，生化儀法及試劑檢測可為臨床提供準確的檢驗數據。