南昌市周邊主要水產養殖區池塘養殖草魚體內優勢細菌調查

徐先棟，付輝云，陳文靜，章海鑫，饒 毅，周智勇

(江西省水產科學研究所，江西 南昌 330039)

隨著生活水平的提高，消費者對水產品的需求由數量型轉為質量型，對優質水產品的需求越來越迫切[1-2]。水產品品質受到養殖水質、投喂策略、流通加工等環節影響，現有文獻對上述幾種因素與水產品品質的關系多有闡述[3-5]，池塘養殖水產品體內含有的優勢菌群也是影響水產品品質的一大因素[6]，目前相關報道較少。江西省南昌市地處長江中下游、鄱陽湖畔、贛江之濱，為魚米之鄉，是我國主要的淡水水產品生產地區。本文對江西省南昌市周邊地區的池塘養殖草魚體內細菌進行調查，探索養殖草魚體內優勢菌群的種類，對所分離的細菌進行遺傳背景分析，并挑選不同地區的分離菌進行藥敏實驗，以分析該地區草魚體內優勢菌群分布情況及耐藥性，為漁業生產以及水產品品質評估提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

TSA和TSB培養基購自北京陸橋技術股份有限公司，DNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、DL2000 marker、dNTPs和 Ex Taq酶均購自大連寶生物公司。

1.2 細菌分離

細菌樣品采集自江西省南昌市周邊主要水產養殖區，包括蔣巷鎮、羅家集鎮、塘南鎮、南新鄉等鄉鎮的草魚養殖池塘(圖1)，采樣時間為2016年6～10月。在每個采樣地點分別隨機取3尾草魚，用滅菌純凈水清洗體表，然后使用75%酒精棉球擦拭體表，在酒精燈焰旁解剖草魚，用TSA平板從魚體肝臟部位分離細菌，采用劃線分離培養的方法進行培養，于30 ℃培養24 h后記錄結果。挑取形態一致的優勢菌以TSA培養基純化培養，直至獲得純培養菌。同時將優勢菌株培養液與等體積50%甘油混合，于-80 ℃冰箱中長期保存備用。

圖1 采樣點示意圖(黑點標示為采樣地點)

1.3 16S rDNA序列測定與分析

純化后的分離菌經振蕩培養24 h后，使用試劑盒提取細菌總DNA，對病原菌的16S rDNA序列進行PCR擴增與測序。PCR引物為：正向引物27F 5′- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，反向引物1492R 5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT-3′，擴增目的片段大小約為1.5 kb。

PCR反應體系(50 μL)：ExTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L)4 μL，10×PCR緩沖液(含Mg2+)5 μL，正向引物27F(10 μmol/L)1 μL,反向引物1492R(10 μmol/L)1 μL，DNA模板2 μL，加超純水至總體積50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸90 s，30個循環；最后于72 ℃溫育10 min。1%瓊脂糖電泳觀察結果。PCR產物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司進行核苷酸序列測定。所測序列通過Genbank同源性比對，鑒定分離菌株。

1.4 ERIC-PCR分型

腸桿菌基因間重復共有序列(Enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)-PCR特異性引物序列為：正向引物(F):5′-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3′；反向引物(R):5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′。ERIC-PCR反應體系為：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L)2 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，TaKaRa ExTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，以滅菌ddH2O補足至25 μL。反應條件為：95 ℃預變性7 min；90 ℃變性30 s、52 ℃退火1 min、65 ℃延伸8 min，35個循環；最后于68 ℃溫育16 min。PCR擴增產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓80 V，時間2 h，拍照觀察。

1.5 藥敏實驗

根據細菌鑒定結果，隨機選取不同地方分離的代表菌株，使用藥敏紙片擴散法對選取的菌株進行藥敏檢測[7]。方法如下，菌株經Muller-Hinton肉湯培養基過夜培養，使用麥氏比濁管調整細菌濃度為108CFU/mL。取100 μL菌液，涂布Muller-Hinton瓊脂平板，使用無菌鑷子取藥敏紙片，貼于平板表面，輕壓一下紙片，每個平板均勻貼布6片紙片。30 ℃培養24 h，記錄抑菌圈直徑。參照CLSI藥敏紙片解釋標準[7]，判斷菌株對藥物的敏感性，結果記為敏感(susceptible，S)，中度敏感(intermediary，I)和抗藥(resistant，R)。共選擇了8類12種藥敏紙片用于實驗(表1)。

1.6 數據統計

數據統計使用Excel 2007軟件進行。

表1 藥敏實驗所用藥敏紙片種類

2 結果

2.1 草魚體內細菌分離結果

本次對南昌市周邊地區池塘養殖草魚體內細菌進行分離純化，共得到56株優勢菌株，對優勢菌株的16S rDNA基因進行了擴增和測序，得到全部菌株的16S rDNA片段，Genbank登錄號為KY767483～KY767538(表2)。56株菌株16S rDNA基因序列在Genbank中的同源性比對結果顯示，81%的菌株為不動桿菌屬細菌，其中34株細菌鑒定為抗輻射不動桿菌(Acinetobacterradioresistens)，占總菌株數的61%，8株細菌鑒定為約氏不動桿菌(Ac.johnsonii)，占總數的14%，其他不動桿菌屬細菌包括瓊氏不動桿菌(Ac.junii)、鮑曼不動桿菌(Ac.baumannii)及皮特不動桿菌(Ac.pittii)各1株，占總數的6%。有7株菌株16S rDNA序列與維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)標準菌株(ATCC35624)比較，相似率大于97%，初步鑒定為維氏氣單胞菌[8]，占總菌株數的12%，另外戴爾福特菌(Delftiatsuruhatensis)2株，芽孢桿菌屬細菌(Bacillus)及葡萄球菌屬細菌(Staphylococcus)各1株。

表2 草魚體內分離細菌信息表

注：BL北瀝，CC滁槎，GH國鴻，JX蔣巷，LJ羅家集，NX南新，TN塘南，WA五愛，YH瑤湖。

2.2 ERIC-PCR分型結果

分離的34株抗輻射不動桿菌ERIC分型結果(圖2)表明，ERIC-PCR條帶相似，都能擴增出約9條條帶，含有一條大小約為1600 bp明顯條帶。約氏不動桿菌ERIC分型結果表明有4株菌條帶相似，其他3株菌條帶存在差異(圖3)，瓊氏不動桿菌、鮑曼不動桿菌及皮特不動桿菌均擴增出約10條條帶(圖3)。7株維氏氣單胞菌ERIC分型結果表明，各菌擴增條帶均不一樣，條帶數在3～10條不等，多態性明顯(圖4)。

1-WA16091, 2-WA16092, 3-WA16094, 4-JX16091, 5-JX16094, 6-JX16097, 7-JX16090, 8-JX16095, 9-YH16104, 10-CC16102, 11-LJ16108, 12-LJ16107, 13-LJ16106, 14-LJ16105, 15-LJ16104, 16-LJ16103,17- TN16102,18-TN16101, 19-NX16101, 20-NX16102, 21-NX16103, 22-JX16096, 23-TN16103, 24-TN16104, 25-GH16093, 26-GH16092, 27-LJ16091, 28-GH16091, 29-JX16913, 30-WA16095, 31-JX16914, 32-JX16911, 33-JX16916, 34-JX19915.

圖234株抗輻射不動桿菌ERIC-PCR指紋圖譜

Lnae M：DL2000 Marker；1-JX16093, 2-JX16099, 3-YH16105, 4-CC16101, 5-BL16102, 6-YH16101, 7-CC16103(Ac.Johnsonii); 8-JX16092(Ac.junii), 9-YH16102(Ac.pittii), 10-WA16096(Ac.baumannii)

圖3其他不動桿菌ERIC-PCR指紋圖譜

2.3 藥敏實驗結果

選取的17株菌藥敏結果見表3和圖5。不動桿菌屬細菌對慶大霉素、丁胺卡那霉素、恩諾沙星敏感，對青霉素耐藥。大部分不動桿菌屬細菌對對頭孢曲松、四環素和復方新諾明敏感，對氨芐西林、氯霉素、氟苯尼考、多粘菌素b耐藥。所有的維氏氣單胞菌對慶大霉素、丁胺卡那霉素、恩諾沙星、頭孢曲松、復方新諾明、多粘菌素b、氟苯尼考敏感，對青霉素耐藥，絕大部分的維氏氣單胞菌對四環素、氯霉素類藥物敏感，對氨芐西林耐藥。不動桿菌細菌耐藥性最高的菌株為NX16101，對6種藥物表現耐藥性，最低的為JX16091，只對青霉素和麥迪霉素兩種藥物耐藥，其余菌株耐藥種類為3～5種不等。維氏氣單胞菌菌株只對2～3種藥物耐藥。

M：DL2000 Marker；1-BL16104, 2-JX16104, 3-BL16103, 4-BL16105, 5-JX16102, 6-YH16103, 7-JX161021

圖4維氏氣單胞菌ERIC-PCR指紋圖譜

3 討論

隨著我國水產養殖業的發展，養殖魚數量占據比重大大超過捕撈魚類數量，如2016年全國水產品總產量6699.65萬t，其中，養殖產量4937.90萬t，占總產品的73.7%[9]，漁業生產的主要矛盾也已由原來的漁獲物數量需要同產能不足之間的矛盾，轉變為日益增長的優質水產品需要同優質水產品數量不足之間的矛盾，養殖水產品質量問題日益引起消費者的重視。水產品質量受養殖、流通和加工等環節中的多種因素影響，其中養殖環節中水產品體內所含菌群種類對水產品質量影響很大[6]。有些菌群是新鮮魚類正常寄生菌群，對魚肉品質影響不大，有學者對新鮮養殖魚體內主要菌群進行了研究，表明不動桿菌屬細菌為新鮮魚體內優勢菌。如王航[6]從新鮮草魚肉中共分離出58株菌，結果表明新鮮魚肉中的微生物主要為革蘭氏陰性菌，不動桿菌屬細菌是新鮮草魚片的化勢菌，占總菌數的33%。Parlapani等[10]研究了養殖海鱸的初始微生物構成，也發現不動桿菌屬(Acinetobacter)是其優勢菌屬。有些菌群對魚品質造成很大影響，常常使魚肉腐敗發臭，為腐敗菌，主要包括氣單胞菌屬(Aeromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和希瓦氏菌屬(Shewanella)細菌。腐敗草魚中的優勢菌群主要為上述幾種腐敗菌[6]。本文從南昌周邊養殖池塘草魚體內分離的優勢菌株，79%為不動桿菌屬細菌，較少見腐敗菌及致病菌，表明在草魚養殖階段品質較好，可能與南昌周邊地區位于贛江之濱、鄱陽湖畔，擁有豐富的水資源以及優質的水質環境有關。不過，值得注意的是本研究從魚體分離的腐敗菌氣單胞菌屬細菌的16S rDNA序列與維氏氣單胞菌標準菌株相似度最高，大于97%，很大可能均為維氏氣單胞菌，該菌為一種條件致病菌，在水質惡化、水產動物免疫力低等情況下，感染水產動物致動物患病[11-12]。近年來，維氏氣單胞菌病呈現多發趨勢，已成為我國淡水養殖動物最重要的細菌性病原之一[13-14]，需要引起重視。

表3 草魚體內分離菌對12種抗生素的藥敏結果

注：S敏感，I中度敏感，R耐藥；判定標準：小于中間數值為抗藥，中間數值為中度敏感，大于中間數值為敏感；數字為抑菌圈直徑，單位mm；*為維氏氣單胞菌，#為約氏不動桿菌，其他為抗輻射不動桿菌細菌。

ERIC-PCR是一種常用的細菌分子分型手段，具有不要求模板序列已知而能直接進行PCR擴增的優點，同時，由于其引物序列較長，PCR反應退火溫度較高，因此能得到穩定性好、重復性高、多態性豐富的電泳圖譜，可用來區分同一種類細菌的不同株(型)[15]。在不動桿菌屬細菌分型研究中，有學者應用ERIC-PCR技術對鮑曼不動桿菌(Ac.baumannii)進行過分型研究，通過分型可以對細菌的來源及遺傳特性分類，主要的條帶位置和數量相同可視為同一個基因型[16]。對抗輻射不動桿菌的分型尚未見報道，本文研究的抗輻射不動桿菌均為同一個ERIC型，表明本研究所分離的抗輻射不動桿菌可能來源于同一個遺傳型。ERIC-PCR技術對維氏氣單胞菌分型研究多有報道[17-19]，該方法是一種針對維氏氣單胞菌分型研究成熟的方法。本文中6株維氏氣單胞菌的ERIC-PCR條帶均不一樣，表明該地區的維氏菌多態性比較豐富，不過因本研究所采用的維氏氣單胞菌株數量較少，不完全代表該地區的維氏氣單胞菌遺傳性特征。該地區的維氏氣單胞菌更詳細的分型以及主要遺傳性菌株研究有待進一步發掘。

圖5 不動桿菌屬細菌(A)和維氏氣單胞菌(B)對不同抗生素耐藥菌株數分析

抗輻射不動桿菌的藥敏研究較少見報道，同屬的鮑曼不動桿菌因其對人類健康的重要影響——是我國目前最重要的“超級細菌”[20]，藥敏研究報道較多[21-22]。本文分離的抗輻射不動桿菌僅表現出對青霉素、麥迪霉素全部抗藥，對多粘菌素b絕大部分抗藥，對其他藥物藥敏或多或少地表現出敏感或全部敏感，為低耐藥性菌株。不過，值得注意的是不同于臨床分離的鮑曼不動桿菌，普遍具有較強的耐藥性而對“非常規抗生素”多粘菌素均較敏感[21,23]，本文分離的抗輻射不動桿菌對多粘菌素具有較強的耐藥性。推測原因有可能是抗輻射桿菌本身不同于鮑曼不動桿菌的特性，或是南昌周邊地區的抗輻射不動桿菌由于選擇壓力獲得抗藥性，確切原因有待更多的抗輻射不動桿菌藥敏實驗研究證實。

本文分離的維氏氣單胞菌均對青霉素表現出耐藥性，對青霉素類藥物耐藥可能是氣單胞屬細菌的固有耐藥性[24]。對喹諾酮類、氯霉素類、第三代頭孢類藥物敏感，同已有報道不盡相同[25-27]，可能與維氏氣單胞菌的耐藥性存在地域差別，不同地區，不同來源菌株耐藥性均不同有關[13]。本文分離的維氏氣單胞菌耐藥性較低，同作者前期研究嗜水氣單胞菌結果相類似[28]，表明南昌周邊地區草魚養殖抗生素使用比較合理，菌株沒有產生大規模的多重耐藥性。本文選用了青霉素、氯霉素、丁胺卡那霉素等幾種禁用藥物進行藥敏實驗，僅用于研究菌株的耐藥性，不作為生產上病害防治用藥參考。