H9N2亞型禽流感病毒HA檢測片段陽性質(zhì)粒的構(gòu)建

楊 婧,劉宇卓,劉青濤,趙冬敏,章麗嬌,黃欣梅,韓凱凱,李 銀

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部 獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室,江蘇 南京 210014)

禽流感(Avian Influenza, AI)是由正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒屬A型流感病毒中任一亞型引起的家禽、野鳥和部分哺乳動物發(fā)病的一種傳染病[1-2]。高致病性禽流感會引起家禽高發(fā)病率及高死亡率,而低致病性禽流感則會導致家禽出現(xiàn)呼吸道癥狀、生長發(fā)育受阻及產(chǎn)蛋下降等,嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[3]。根據(jù)A型流感病毒表面糖蛋白血凝素蛋白(Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨基酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性不同,可將A型流感病毒分為不同的亞型,目前已發(fā)現(xiàn)有18種HA亞型和11種NA亞型,其中H17N10和H18N11僅在蝙蝠中分離鑒定[4-5]。根據(jù)致病性不同，又可將禽流感分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感[6]。由H5和H7亞型毒株所引起的禽流感一般稱為高致病性禽流感(HPAI),其發(fā)病率和病死率都很高,危害極大[7-8],被OIE列為必須報告的動物傳染病,我國將其列為一類傳染病。而禽類中暴發(fā)的低致病性禽流感的亞型主要為H5N2、H9N2亞型。

H9N2亞型禽流感病毒呈世界性分布,按地區(qū)可分為北美和歐亞兩個種系[9]；我國分離的毒株多為歐亞種系,而A/Chicken/Heilongjiang/35/00則為北美種系[10]。我國于1994年首次從雞體內(nèi)分離出H9N2亞型禽流感病毒[11]。近些年我國每年均可分離到大量的H9亞型禽流感病毒,在臨床上被感染的雞常見蛋雞產(chǎn)蛋量下降、肉雞生長發(fā)育遲緩甚至死亡的現(xiàn)象；當其與其它病原共感染時會導致高死亡率,給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。同時H9亞型AIV可以感染人、豬等哺乳動物,因此對其進行研究在公共衛(wèi)生上具有重要意義[12]。

實驗室在進行H9N2亞型禽流感病毒檢測時,一般先用血凝/血凝抑制試驗進行初篩,再用PCR方法進行確診。在進行PCR試驗時,需要已知的H9N2病毒作為陽性參考,而有活性的H9N2病毒存在感染人類及散播病毒的危險,滅活的H9N2病毒又有保存條件的限制,普通的實驗室不具備長期保存的資質(zhì),因此,需要構(gòu)建一個可以用于檢測H9N2亞型禽流感病毒HA片段的陽性質(zhì)粒,要求該質(zhì)粒在-20 ℃即可保存,使用方便,不會污染環(huán)境,不存在散播病毒的危險。我們按照農(nóng)業(yè)部的NYT 772─2013標準，構(gòu)建了487 bp長的HA檢測片段陽性質(zhì)粒,并對該質(zhì)粒的特異性、敏感性和重復性進行了分析,以期獲得可用于檢測H9N2亞型禽流感病毒HA片段的陽性質(zhì)粒。

1 試驗材料

H9N2亞型禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/WX5/2017由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所家禽與生物獸藥研究室家禽重大疫病防控項目組分離鑒定并保存。

PMD18-T、PMD20-T、反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)、RNase Out、10 mmol/L dNTP、5×Buffer、10× PCR Buffer、2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L MgCl2、聚合酶(E×Taq)均購自寶生物工程(大連)有限公司;E.coliDH5α感受態(tài)細胞購自寶生物工程(大連)有限公司和南京諾維贊生物科技有限公司;0.22 μm微孔濾膜過濾器購自Millipore lreland Ltd.;生理鹽水(pH 6.8～7.0)、LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基由本實驗室自制;1%雞紅細胞溶液由本實驗室自制,現(xiàn)用現(xiàn)配;瓊脂糖(BIOWEST AGAROSE G-10)購自Gene Company LTD公司; DL2000 DNA Marker購自DSBIO生物公司;氨芐青霉素、核酸染料購自上海蒲迪生物公司; RNA/DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自康寧生命科學有限公司;行標特異引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，陽性質(zhì)粒的測序也由該公司完成。

本試驗所用的儀器設備還有：超高速低溫離心機(Eppendorf)、水浴鍋(一恒科技)、Gradient PCR(Takala)、核酸凝膠電泳系統(tǒng)(南大普陽)、核酸凝膠成像系統(tǒng)(JS-680B)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(上海光都)、37 ℃搖床(華美生化)、高壓鍋(徐州圣業(yè)SY-450)。

2 試驗方法

2.1 H9N2病毒RNA的提取

將A/Chicken/Jiangsu/WX5/2017樣品在無菌條件下取出200 μL，置于高壓滅菌后的1.5 mL離心管中,加入200 μL的V-L試劑后,用渦旋振蕩儀混勻,靜置5 min;加入75 μL V-N試劑,用渦旋振蕩儀混勻,以12000 g的轉(zhuǎn)速離心5 min;取上清加在新的2 mL離心管中,再加入300 μL異丙醇(含無水乙醇),上下倒置混勻,轉(zhuǎn)移至新的含有吸附柱的2 mL離心管中,以6000 g離心1 min;棄濾液,加入500 μL Buffer W1(含無水乙醇),以12000 g離心1 min;棄濾液,加入800 μL Buffer W2(含無水乙醇),以12000 g離心1 min;棄濾液,以12000 g離心1 min;將吸附柱置于新的1.5 mL離心管中,加入15 μL的TE試劑,靜置1 min,然后以12000 g離心1 min。此即為提取的H9N2亞型禽流感病毒RNA。

2.2 病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄RT和PCR擴增

反轉(zhuǎn)錄體系為: RNA 12 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL、5×Buffer 4 μL、Unit 12 1 μL、M-MLV 1 μL、RNase Out 0.5 μL。反轉(zhuǎn)錄程序為:65 ℃ 5 min→42 ℃ 60 min→98 ℃ 5 min。

PCR擴增體系為: cDNA 2.75 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10×Buffer 2.5 μL、ddH2O 14 μL、25 mmol/L MgCl21.5 μL、E×Taq 0.25 μL、上游引物P1(5′-CTCCACACAGAGCAYAATGG-3′) 1 μL、下游引物P2 (5′-GYACACTTGTTGTTGTRTC-3′) 1 μL。PCR擴增程序為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,72 ℃ 40 s,共35個循環(huán);72 ℃ 10 min。

2.3 電泳和核酸膠純化

配制1%瓊脂糖凝膠,進行電泳。調(diào)節(jié)電泳儀為穩(wěn)壓模式,在80 V下電泳30 min。將陽性條帶切下后,用膠回收試劑盒純化陽性條帶。

在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠,稱重后作為1個凝膠體積,加入3個凝膠體積的Buffer DE-A,混合均勻后于75 ℃加熱,每2～3 min混合1次,直至凝膠塊被完全熔化;加入0.5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B,混合均勻;將此混合液轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2 mL離心管)中,以12000 g離心1 min,棄濾液;將制備管置回2 mL離心管中,加入500 μL Buffer W1(含無水乙醇),以12000 g離心30 s,棄濾液;將制備管置回2 mL離心管中,加入700 μL Buffer W2(含無水乙醇),以12000 g離心30 s,棄濾液;再加入700 μL Buffer W2(含無水乙醇),以12000 g離心1 min,棄濾液;將制備管置回2 mL離心管中,以12000 g離心1 min;將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管中,在制備膜中央加25 μL ddH2O,在室溫下靜置1 min,以12000 g離心1 min洗脫DNA。

2.4 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的構(gòu)建和篩選

將膠回收的目的基因按照連接體系(10 μL): DNA 4 μL、pMD18-T Vector 1 μL、SolutionⅠ5 μL,在4 ℃下過夜連接,構(gòu)建HA檢測片段克隆載體。

從-70 ℃處取出E.coliDH5α感受態(tài)細胞,于手心迅速融化,然后置于冰上融化15 min,將10 μL連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞中,并輕柔吹打混合均勻,立即冰浴30 min；然后迅速放入42 ℃水浴鍋中,熱激90 s,再立即冰浴5 min；結(jié)束后,每管內(nèi)加入900 μL SOC培養(yǎng)基,置于37 ℃恒溫搖床,以120 g低速培養(yǎng)1 h，然后以4800 g離心5 min,吸取上清900 μL,在剩余培養(yǎng)基中將菌塊吹散均勻,并加入20 μL IPTG和40 μL X-Gal,混合均勻后,將菌液吸取滴加到含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中,用灼燒過的無菌玻璃棒將菌液涂布均勻；進行標記,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)12～16 h。

將37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜的LB固體培養(yǎng)基取出,用白槍頭挑取透明單菌落,每塊板子挑取7～10個單菌落,置于2 mL含0.1%氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫搖床上以180 g培養(yǎng)10～12 h。對培養(yǎng)后的菌液進行PCR鑒定；電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察是否有陽性條帶,如有,則取500 μL菌液送金斯瑞(南京)生物科技有限公司進行測序,測序完成后用DNAStar進行序列分析。經(jīng)軟件比對后,將序列正確的菌液按1%擴大培養(yǎng),在37 ℃恒溫搖床上以180 g培養(yǎng)12～16 h后進行質(zhì)粒提取。

質(zhì)粒提取方法如下:取1～4 mL在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌液,以12000 g離心1 min,棄上清;加入250 μL Buffer S1(已加RNase A),充分懸浮細菌沉淀,確保菌液中無小菌塊;加入250 μL Buffer S2,上下輕柔翻轉(zhuǎn)4～6次以混合均勻,使菌體充分裂解形成透亮均一的溶液,此步驟不超過5 min;加入350 μL Buffer S3,上下輕柔翻轉(zhuǎn)4～6次以混合均勻、充分,再以12000 g離心10 min;吸取上清,轉(zhuǎn)移到DNA制備管中,以12000 g離心1 min,棄濾液;加500 μL Buffer W1,以12000 g離心1 min,棄濾液;加700 μL Buffer W2(含無水乙醇),以12000 g離心1 min,棄濾液;再次用700 μL Buffer W2(含無水乙醇)洗滌1次,以12000 g離心1 min,棄濾液;將制備管置回到2 mL EP管中,以12000 g離心1 min;將制備管置于潔凈的1.5 mL EP管中,在制備管膜中央加60～80 μL Eluent或去離子水,在室溫下靜置1 min，然后以12000 g離心1 min,充分洗脫質(zhì)粒；將質(zhì)粒DNA保存于-20 ℃。

2.5 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的特異性鑒定

以H5禽流感病毒(H5)、H7禽流感病毒(H7)、H9禽流感病毒(H9)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)特異性引物同時對HA檢測片段質(zhì)粒進行PCR擴增,檢驗其特異性,對擴增后的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

2.6 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的敏感性鑒定

用雙蒸水對HA檢測片段質(zhì)粒進行10倍系列稀釋,得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10倍稀釋液,分別用H9行標特異引物進行PCR擴增,檢驗其敏感性；對擴增后的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

2.7 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的重復性鑒定

用雙蒸水將HA檢測片段質(zhì)粒作100倍系列稀釋,用H9行標特異引物進行PCR擴增,做6個重復,檢驗其重復性；對擴增后的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 H9N2病毒的RT-PCR

由電泳圖1可知, A/Chicken/Jiangsu/WX5/2017在行標特異引物擴增下可得到487 bp長度的HA片段。

1:陰性對照;2: ddH2O;3: A/Chicken/Jiangsu/WX5/2017;4: A/Chicken/Jiangsu/WX5/2017;M:2000 bp Marker。

3.2 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的測序鑒定

對含HA檢測片段的陽性菌液用行標特異引物進行PCR擴增后,在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳,將陽性條帶的菌液進行測序,得到其序列(見圖2)；經(jīng)在線BLAST分析，其仍為H9N2禽流感病毒,且與原病毒的同源性達100%(圖3)。

圖2 HA檢測片段陽性菌液的測序結(jié)果

3.3 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的特異性鑒定

以H5、H7、H9、IBDV、NDV、IBV特異性引物同時對HA檢測片段陽性質(zhì)粒進行PCR擴增,以檢驗其特異性,對擴增后的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,結(jié)果如圖4所示,僅用H9特異性引物擴增時出現(xiàn)陽性條帶,而用其余引物擴增時均未出現(xiàn)陽性條帶。

圖3 HA檢測片段陽性菌液與原病毒HA片段的同源性比較

3.4 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的敏感性鑒定

用雙蒸水將HA檢測片段陽性質(zhì)粒作10倍系列稀釋,用H9行標特異引物進行PCR擴增,檢驗其敏感性；對擴增后的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,結(jié)果如圖5所示,對10-1、10-2、10-3、10-4倍稀釋液進行擴增時,均出現(xiàn)了陽性條帶。

3.5 HA檢測片段陽性質(zhì)粒的重復性鑒定

用雙蒸水將HA檢測片段陽性質(zhì)粒作100倍系列稀釋,用H9行標特異引物進行PCR擴增,做6個重復,檢驗其重復性；對擴增后的PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,結(jié)果如圖6所示,6個重復均出現(xiàn)了陽性條帶。

1: H5特異性引物擴增;2: H7特異性引物擴增;3: H9特異性引物擴增;4: IBDV特異性引物擴增;5: NDV特異性引物擴增;6: IBV特異性引物擴增;7:2000 bp Marker。

圖4HA檢測片段陽性質(zhì)粒特異性鑒定結(jié)果

4 討論

在本研究中,參考農(nóng)業(yè)部NYT 772─2013標準設計的H9特異引物可以擴增出487 bp大小的條帶,該SOP適用于規(guī)范H9亞型禽流感RT-PCR檢測方法的操作,是檢測H9亞型禽流感的金標準；根據(jù)此標準構(gòu)建相應的檢測H9N2亞型禽流感病毒HA片段的陽性質(zhì)粒,通過對陽性菌液測序、NCBI在線BLAST分析、與原病毒HA片段進行同源性比較等鑒定，確認該陽性質(zhì)粒構(gòu)建成功。同時,對該陽性質(zhì)粒的特異性、敏感性和重復性進行分析后,可以證明該HA片段的陽性質(zhì)粒特異性較高，敏感性能達到10-4倍稀釋，重復性較穩(wěn)定,是可用于檢測H9N2亞型禽流感病毒HA片段的陽性質(zhì)粒。

1:10-1倍稀釋;2:10-2倍稀釋;3:10-3倍稀釋;4:10-4倍稀釋;5:10-5倍稀釋;6:2000 bp Marker;7:10-6倍稀釋;8:10-7倍稀釋;9:10-8倍稀釋;10:10-9倍稀釋;11:10-10倍稀釋。

圖5HA檢測片段陽性質(zhì)粒敏感性鑒定結(jié)果

1:重復1;2:重復2;3:重復3;4:重復4;5:重復5;6:重復6;7:2000 bp Marker。

禽流感的早期診斷對于控制疫情具有重要的意義。一般通過病禽的流行病學、臨床癥狀、病理變化可做出禽流感的初步判斷；但若需做出準確診斷,則需要檢測禽流感病毒的抗原、基因或者分離鑒定病毒。目前對于禽流感的診斷主要通過檢測禽流感抗原,其檢測方法有[13]:血凝/血凝抑制試驗(HA/HI)、抗原捕捉ELISA、熒光抗體和免疫酶組化法等。檢測禽流感基因的方法主要有: RT-PCR法和標記核酸探針原位雜交法，以RT-PCR法較為敏感和特異,為WHO所推薦的方法之一。本試驗成功構(gòu)建了用于檢測H9N2亞型禽流感病毒HA片段的陽性質(zhì)粒,在-20 ℃下即可保存,使用方便,并且不會污染環(huán)境,不存在散播病毒的危險。